家禽Gal-6基因片段克隆與成熟肽基因表達(dá)的研究.pdf

1、β-防御素屬抗菌肽,因具有廣譜抗微生物和增強(qiáng)免疫作用以及對(duì)病原微生物不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。為探討β-防御素在家禽體內(nèi)的表達(dá)分布情況和抗菌活性,本研究以家禽β-防御素Gal-6為研究對(duì)象,運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù),從安徽三黃雞、皖西白鵝、巢湖麻鴨不同組織中克隆出Gal-6基因片段,并構(gòu)建pGEM-TEasy-Gal-6克隆載體和pGEX-4T-1-Gal-6表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)后純化得融合蛋GST-Gal-6,對(duì)純化

2、產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了初步研究。具體內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.應(yīng)用RNA Trizol Reagent試劑盒抽提法,從安徽三黃雞、皖西白鵝的骨髓和巢湖麻鴨不同組織中提取總RNA?？俁NA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后得到兩條清晰的條帶(28s和18s),經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280值在1.8-2.0之間,RNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求。 2.參考GenBank注冊(cè)的雞β-防御素cDNA序列(NM_001001193),設(shè)計(jì)兩對(duì)引物P

3、1/P2、P3/P4,P1/P2擴(kuò)增Gal-6基因片段,P3/P4擴(kuò)增編碼成熟肽基因。抽提總RNA用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR),從安徽三黃雞、皖西白鵝的骨髓和巢湖麻鴨不同組織中克隆出目的基因,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,構(gòu)建pGEM-T Easy-Gal-6克隆載體。提取純化重組的克隆質(zhì)粒并測(cè)序,經(jīng)GenBank的BLAST比對(duì)：克隆安徽三黃雞Gal-6獲得的249bp堿基在第246位有一堿

4、基變異,同源性達(dá)99％；克隆皖西白鵝Gal-6所獲得的249個(gè)堿基完全相同,同源性達(dá)100％；克隆巢湖麻鴨Gal-6獲得247個(gè)堿基在第12bp處缺少一個(gè)T堿基,在242bp處缺少一個(gè)T堿基,同源性達(dá)99％。分析Gal-6編碼框分別由20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽、5個(gè)氨基酸的原片段、42個(gè)氨基酸的成熟肽組成。以pGEM-T Easy-Gal-6質(zhì)粒為模板, P3/P4為引物PCR擴(kuò)增出126bp堿基的成熟肽基因片段。 3.檢測(cè)Gal

5、-6在巢湖麻鴨小腸、腎臟、肝臟等16個(gè)不同組織的表達(dá)分布情況。結(jié)果表明,除皮膚、腎臟、法氏囊外,而其他組織均檢測(cè)到Gal-6的表達(dá)。 4.首次將所克隆的巢湖麻鴨、皖西白鵝Gal-6基因序列提交GenBank,獲得巢湖麻鴨Gal-6注冊(cè)序列號(hào)(EU366148)、皖西白鵝Gal-6注冊(cè)序列號(hào)(EU606039)。 5.巢湖麻鴨Gal-6成熟肽基因和pGEX-4T-1載體雙酶切后連接,構(gòu)建pGEX-4T-1-Gal-6表達(dá)載

6、體。PCR鑒定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子增菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),融合蛋白經(jīng)SOS-PAGE鑒定。結(jié)果表明,GST-Gal-6融合蛋白分子量約為33kD,可存在于上清和沉淀中,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4h,30℃培養(yǎng)時(shí)可溶性融合蛋白在上清液中的濃度高于37℃培養(yǎng)。融合蛋白上清液經(jīng)谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂柱親和層析純化得GST-Gal-6融合蛋白。分光光度計(jì)檢測(cè)GST-Gal-6融合蛋白含量為0.2613mg/mL。單層瓊脂平板擴(kuò)散法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物體外生物活性,對(duì)大腸