IBDV VP2高變區(qū)基因片段的克隆、表達(dá)及其鑒定.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是一種危害幼雞的急性、高度接觸性、病毒性傳染病。傳染性法氏囊病毒(IBDV)除引起3-6周齡易感雞發(fā)生死亡外,可致雛雞免疫抑制,導(dǎo)致雞群對(duì)新城疫、馬立克氏病及傳染性支氣管炎等多種主要疫病的免疫失敗。為了建立一個(gè)準(zhǔn)確快速的診斷方法,分析我國(guó)目前使用的疫苗株的抗原基因是否發(fā)生了變異以及進(jìn)一步建立能夠鑒別感染雞體內(nèi)是否是由疫苗免疫所產(chǎn)生抗體的方法,本研究初步建立了檢測(cè)IBDV的RT-PCR方法、獲得了VP2蛋白的抗原決

2、定區(qū)域的基因,構(gòu)建了該基因的重組質(zhì)粒,并且成功表達(dá)了VP2基因的部分片段。 首先,根據(jù)Genbank中已登錄的傳染性法氏囊病毒VP2基因序列和在前人研究成果的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了含酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基的一對(duì)引物,P1:5‘-CGGAATTCCCAAAAATGGTAGCCA-3’P2:5‘-GCGTCGACTGCCACTCTTTCGTAGG-3’,以弱毒疫苗滅菌生理鹽水稀釋液為毒種,SPF雞胚接種法增殖IBDV病毒,以尿囊液離心后的沉淀

3、物為材料,采用 Trizol試劑法提取病毒的總RNA,進(jìn)行RT-PCR,擴(kuò)增出大小為504bp的基因片段(記為P12),與預(yù)期的結(jié)果一致。將其插入到質(zhì)粒載體PGEX-4T-1上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆和質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定后測(cè)序。序列分析表明,P12與登錄號(hào)為DQ202329的國(guó)內(nèi)毒株的同源性達(dá)99.8％以上,與國(guó)外毒株AY134874、AY598356、AF109154的同源性分別為93.5％、93.5％、94

4、.8％,這表明本實(shí)驗(yàn)已成功地?cái)U(kuò)增了目的基因,為建立檢測(cè)IBDV的RT-PCR快速診斷方法奠定了基礎(chǔ)。 其次,根據(jù)GenBank中登錄的傳染性法氏囊病毒基因序列及原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-I的多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)了另兩條原核表達(dá)引物.P3:5’.CGGAATTCATGCCATTCAATCTTGTG-3’；P4:5’-GCGTCGACTGCTAGTTCAGGAATTGG-3’。為了便于基因的克隆與表達(dá),我們?cè)谝锏?’端添加了酶切位點(diǎn)

5、及其保護(hù)堿基。以實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增273bp的原核表達(dá)目的片段(記為P34),將其插入到表達(dá)載體PGEX-4T-1上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,經(jīng)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆、雙酶切鑒定后,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后,所表達(dá)的蛋白大小與預(yù)期結(jié)果一致。 綜上所述,本研究用SPF雞胚尿囊液增殖法增殖了傳染性法氏囊病毒,克隆了包括中和抗原表位在內(nèi)的VP2基因高變區(qū),并且成功表達(dá)了含有一個(gè)抗原位點(diǎn)的VP2基因片段