vvIBDVGX8-99株克隆化毒免疫效果檢測(cè)及其與VP2高變區(qū)相關(guān)性分析.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起雞的急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的中樞免疫器官—法氏囊，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。該病毒導(dǎo)致免疫抑制，造成對(duì)其他疫病的易感性增強(qiáng)和降低對(duì)其它疫苗的反應(yīng)性。近年來(lái)，IBDV在分子水平對(duì)IBDV的免疫機(jī)理、致病機(jī)制、病毒分子的結(jié)構(gòu)與功能方面取得很大的進(jìn)

2、展但是仍有有待于進(jìn)一步研究，特別是變異株、vvIBDV的出現(xiàn)，抗原的變異和多樣性血清亞型，使本病在臨床上診斷困難，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。IBDV為雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，利用當(dāng)?shù)胤蛛x的變異株或選用抗原性與當(dāng)?shù)刈儺愔杲咏囊呙缰曛瞥蓽缁蠲缁蛉醵久纾约袄枚喾N毒株聯(lián)合制成多價(jià)疫苗可以使雞群得到很好的免疫保護(hù)。我們?cè)趯?shí)施國(guó)家自然基金重大項(xiàng)目過(guò)程中，感染vvIBDV GX8/99株的雞的發(fā)病率和死亡率比較高，雞場(chǎng)出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象頻繁

3、發(fā)生。本研究以vvIBDV GX8/99株為研究對(duì)象，將vvIBDV GX8/99株進(jìn)行傳代，研究從原始毒（雞源毒）→雞胚毒→ 細(xì)胞適應(yīng)毒→細(xì)胞克隆化毒→克隆化毒株的細(xì)胞傳代至30代的免疫原性的變化規(guī)律及其與核苷酸、氨基酸之間的關(guān)系。以便更好地掌握vvIBDV在整個(gè)傳代致弱的過(guò)程中的免疫原性變化特點(diǎn)、vvIBDV“個(gè)體效應(yīng)”的變化規(guī)律，為我國(guó) vvIBDV分子流行病學(xué)的研究及 IBD的有效防治奠定基礎(chǔ)，從而揭示超強(qiáng)毒的演變規(guī)律和毒力改變

4、的分子基礎(chǔ)，為解決超強(qiáng)毒毒力增強(qiáng)、超強(qiáng)毒能否致弱以及致弱過(guò)程中基因序列和核苷酸序列的變化，這種變化與病毒生物學(xué)特性的關(guān)系，弱毒株的生物學(xué)特性如何等急需解決的問(wèn)題提供依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：vvIBDV GX8/99株病毒的克隆化及其傳代培養(yǎng)。本研究將vvIBDV GX8/99株首先在SPF雞胚上傳10代，然后在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）上盲傳22代，開始適應(yīng)CEF，并引起細(xì)胞病變（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞聚縮，拉成

5、纖絲狀，最后變圓，脫落。再經(jīng)無(wú)限稀釋法進(jìn)行2次病毒的克隆化，篩選得到了4株克隆化病毒。再將該4株克隆化病毒分別連續(xù)在CEF上傳30代。通過(guò)免疫膠體金試紙膜檢測(cè)各傳代毒，除適應(yīng)CEF之前的細(xì)胞毒檢測(cè)不到IBDV外，其余各傳代毒均可檢測(cè)到IBDV。IBDV在細(xì)胞上增殖周期不定，CEF出現(xiàn)病變的時(shí)間有差異隨著克隆化毒株傳代代次的增加，CEF出現(xiàn)病變的時(shí)間也隨之增加，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超強(qiáng)毒GX8/99株從原代毒經(jīng)過(guò)雞胚、CEF，TCID50的變

6、化規(guī)律：從原代毒經(jīng)SPF雞胚傳10代，病毒在適應(yīng)細(xì)胞的在增大，克隆化毒株經(jīng)CEF傳30代得到的克隆化病毒各傳代毒，TCID50均降低。
　　 第二部分：vvIBDV GX8/99克隆化毒株細(xì)胞致弱毒VP2高變區(qū)變異性分析。vvIBDV GX8/99株克隆化細(xì)胞毒GX-IBDVE10C25CL1、GX-IBDVE10C25CL2、GX-IBDVE10C25CL4、GX-IBDVE10C25CL5通過(guò)雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行致弱，分別選取

7、四株克隆化毒株的5代、10代、15代、20代、25代、30代致弱毒株提取RNA，通過(guò)Nested-PCR、基因克隆、核苷酸序列測(cè)定和分析，摸索vvIBDV GX8/99株四株克隆株在細(xì)胞傳代過(guò)程中VP2核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列的變化規(guī)律。4個(gè)細(xì)胞適應(yīng)毒克隆株在測(cè)序的VP2高變區(qū)的約145個(gè)氨基酸中，有12個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了相同的變異，變得與適應(yīng)細(xì)胞的疫苗毒D78株基本一致。氨基酸變異位點(diǎn)主要集中在222位(A→P)、242位(I→V)、

8、248位(L→F)、253位(Q→H)、256位(I→V)、257位(Q→L)、270位(A→T或S)、279位(D→N)、284位(A→T)、294位(T→L)、299位(S→N)、330位(S→R)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明VP2高變區(qū)氨基酸的大部分變異與對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)或組織的親和性的關(guān)系更為密切,出現(xiàn)規(guī)律性的變異。270(A→T)與毒株的致病性以及免疫原性具有相關(guān)性，且位于七肽區(qū)的296位(S→R)與致弱毒株的致病力有關(guān)。
　　 第三部

9、分：vvIBDV GX8/99株4株克隆化毒F10、F20、F25、F30代免疫效果分析。vvIBDV GX8/99株4株克隆化毒F10、F20、F25、F30代以10000TCID50免疫劑量對(duì)14日齡的雛雞經(jīng)口服首免,21日齡二免，記錄死亡情況。所有免疫組于一免后3d、10d，二免后7d、14d、20d、30d，分別取30只實(shí)驗(yàn)組血清，進(jìn)行抗體檢測(cè)以及全血分析，并與40d齡經(jīng)口服2000ELD50的vvIBDV GX8/99，結(jié)果表

10、明10000TCID50免疫劑量對(duì)vvIBDV GX8/99克隆化毒株F20、F25均能提供的100％的保護(hù)，二免后第14d左右抗體濃度達(dá)到高峰。但是不同代次的免疫效果明顯不同，結(jié)合實(shí)驗(yàn)二表明VP2高變區(qū)氨基酸的變異與致弱株的免疫原性關(guān)系不密切。一免后10d采取法氏囊組織觀察病理組織學(xué)變化，四株克隆化毒株的F30代免疫雞雖然造成極個(gè)別的法氏囊的損傷，但是這種損傷是可逆的，結(jié)合第二部分從免疫效果和病理組織學(xué)變化看,4株克隆化毒F30代中G