IBDV致病性與VP5基因關(guān)系及GX8-99株細(xì)胞克隆化毒株免疫原性的研究.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)引起雞的急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的中樞免疫器官一法氏囊，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。該病毒導(dǎo)致免疫抑制，造成對(duì)其他疫病的易感性增強(qiáng)和降低對(duì)其它疫苗的反應(yīng)性。近年來，IBDV在分子水平對(duì)IBDV的免疫機(jī)理、致病機(jī)制、病毒分子的結(jié)構(gòu)與功能方面取得很大的進(jìn)展，但是仍

2、有許多地方有待于進(jìn)一步研究，特別是變異株、vvIBDV的出現(xiàn)，抗原的變異和多樣性、血清亞型，使本病的防治和臨床診斷困難，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。
　　 IBDV為雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，利用當(dāng)?shù)胤蛛x的變異株或選用抗原性與當(dāng)?shù)刈儺愔杲咏囊呙缰曛瞥蓽缁蠲缁蛉醵久?，以及利用多種毒株聯(lián)合制成多價(jià)疫苗，可以使雞群得到很好的免疫保護(hù)。我們?cè)趯?shí)施國(guó)家自然基金重大項(xiàng)目過程中，感染vvIBDVGX8/99株的雞的發(fā)病率和死亡率比較高，雞場(chǎng)

3、出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象頻繁發(fā)生。本課題擬以vvIBDVGX8/99株為研究對(duì)象，將vvIBDVGX8/99株進(jìn)行傳代，研究從原始毒(雞源毒)→雞胚毒→細(xì)胞適應(yīng)毒→細(xì)胞克隆化毒→克隆化毒株的細(xì)胞傳代至30代的致病性，免疫原性的變化規(guī)律及其與核苷酸、氨基酸之間的關(guān)系。更好地掌握vvIBDV在整個(gè)傳代致弱的過程中的免疫原性變化特點(diǎn)、vvIBDV“個(gè)體效應(yīng)”的變化規(guī)律，同時(shí)進(jìn)行不同免疫佐劑對(duì)四株克隆化毒株免疫效果影響的試驗(yàn)以探尋更好的佐劑和疫苗組合

4、，為我國(guó)vvIBDV分子流行病學(xué)的研究及IBD的有效防治奠定基礎(chǔ)。揭示超強(qiáng)毒的演變規(guī)律和毒力改變的分子基礎(chǔ)，為解決超強(qiáng)毒毒力增強(qiáng)、超強(qiáng)毒能否致弱以及致弱過程中基因序列和核苷酸序列的變化，這種變化與病毒生物學(xué)特性的關(guān)系，弱毒株的生物學(xué)特性如何等急需解決的問題提供依據(jù)。
　　 1.超強(qiáng)毒IBDVGX8/99株不同傳代毒致病性與VP5基因的關(guān)系分析
　　 本研究將vvIBDVGX-8/99株原代毒、雞胚毒、克隆化毒、回傳SPF

5、雞10代次毒及克隆化細(xì)胞傳代20代次毒分別測(cè)定ELD50,以相同的ELD50病毒量分別接種SPF雞，從而觀察vvIBDVGX-8/99株在傳代過程中致病性的變化規(guī)律。同時(shí)分別提取病毒RNA，通過RT-PCR、PCR擴(kuò)增、基因克隆、核苷酸序列測(cè)定和分析，對(duì)IBDVGX8/99株的24株不同傳代毒的VP5基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其同源性在94％-100%之間。并且有15個(gè)易發(fā)生變異的位點(diǎn)，其中位點(diǎn)bp#2、#8、#52、#145、#232、#27

6、2、#310、#364、#385、#409的堿基變異引起了相應(yīng)氨基酸的改變，而位點(diǎn)bp#18、#285、#331、#354、#397的堿基變異沒有引起相應(yīng)氨基酸的變化。通過比較分析，可以看到在致死率由原代毒的86.7％降為GXE10的43％時(shí)，VP5基因的核苷酸有四個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異，致死率由GXE10的43％降為GXC23的3.3％H寸，VP5基因的核苷酸有10個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異；而將GXC23克隆化后的4株毒株致病性變化不大，并且僅在G

7、XC11-1的#8位點(diǎn)，GXCl2-1和GXCl4-1的#364位點(diǎn)發(fā)生變異；將4株克隆化毒株回傳SPF雞10代后的致死率有一定程度的回升，且有兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異；4株克隆化毒株在細(xì)胞上連續(xù)傳20代后其致死率都降為0,并且克降株5沒有發(fā)生核苷酸變異，而克隆株1、2、4也僅有一個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生變異。由此推論vvIBDV的致病性與VP5某些氨基酸的變異有一定的關(guān)系，更可能與病毒對(duì)細(xì)胞的親嗜性關(guān)系密切，這為探明超強(qiáng)毒法氏囊病毒毒力改變的分子基礎(chǔ)

8、，從而解釋自然界中vvIBDV出現(xiàn)的原因和致弱的原因提供了佐證。
　　 2.vvIBDVGX8/99克隆化毒株細(xì)胞致弱毒VP5基因原核表達(dá)系統(tǒng)的建立
　　 本研究以vvIBDVGX8/99株4株克隆化細(xì)胞毒GXCL1、GXCL2、GXCL4、GXCL5為研究對(duì)象，將4株已在CEF上連續(xù)傳20代的克隆化細(xì)胞毒通過雞胚成纖維細(xì)胞再傳10代，對(duì)各克隆化毒每隔四代毒株的VP5基因進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)兩部分的測(cè)序結(jié)果，從中選取3株氨基酸

9、序列差異較大的毒株(GXC11-1、GXC12-10、GXC14-25)的VP5基因作為本部分的研究?jī)?nèi)容。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從上述3毒株中擴(kuò)增得到VP5基因，并將其克隆到原核表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-VP5，對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定正確后，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，IBDV-VP5基因在大腸埃希菌Rosetta中得到了正確表達(dá)，所表達(dá)的融

10、合蛋白與IBDV陽性血清具有特異性抗原抗體反應(yīng)。
　　 3.泰山松花粉多糖對(duì)4株IBDV克隆化毒株免疫增強(qiáng)效果的影響
　　 根據(jù)第二部分的研究選取4株氨基酸序列差異顯著的克隆化毒株GXCL1-25、GXCL2-30、GXCL4-25、GXCL5-30,并采用泰山松花粉多糖為免疫佐劑(蜂膠佐劑作為對(duì)照)，對(duì)其免疫效果進(jìn)行分析。將4株細(xì)胞毒測(cè)TCID50統(tǒng)一定量后，每一毒株分別設(shè)置無免疫佐劑(1、4、7、10)，松花粉多糖佐

11、劑(2、5、8、11)，蜂膠佐劑(3、6、9、12)三個(gè)平行試驗(yàn)組，并設(shè)一組生理鹽水空白對(duì)照組(13)。免疫SPF雞，14日齡首免，25日齡進(jìn)行二免。分別于一免疫后0、3、7d，二免后3、10、17、24d采血，用ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)和IL-2水平，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定28與42日齡的外周血淋巴細(xì)胞比率，于28、42日齡每組剖殺5只測(cè)免疫器官指數(shù)，35日齡進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。對(duì)各試驗(yàn)組試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可發(fā)現(xiàn)二免后第10d左右抗體和