新城疫病毒La Sota C5株反向遺傳操作平臺(tái)的優(yōu)化及Class Ⅰ-Ⅱ嵌合弱毒株的構(gòu)建與免疫原性評(píng)價(jià).pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)強(qiáng)毒株引起的一種具有高度傳染性的烈性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為需報(bào)告疾病之一。NDV屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)，禽腮腺炎病毒屬(Avuluvirus)的成員，是單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段、有囊膜的RNA病毒。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的La S

2、ota C5反向遺傳平臺(tái)進(jìn)行了改造和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)改造后的感染性克隆GLa SotaC5與La Sota序列完全一致;且其拯救效率有明顯提高。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了JS10M/F/HN三個(gè)基因替換的重組病毒GLa Sota C5M/F/HN，并比較了其免疫原性。
　　1.新城疫病毒La Sota C5株感染性克隆的改造與優(yōu)化
　　參照La Sota C5株的全基因序列，將基因組分成4段，經(jīng)RT-PCR從La Sota C5株感染的尿囊

3、液中擴(kuò)增目的片段，分別連入克隆載體中;然后順次克隆到pMD-20T載體中，構(gòu)建含有La Sota C5基因組大部分片段的中間質(zhì)粒T-ABCD。該質(zhì)粒和前期構(gòu)建的TVT-LT分別經(jīng)BglⅡ酶切后回收大片段，最后連接為含有病毒全長(zhǎng)cDNA的轉(zhuǎn)錄載體TVT-G LaSota C5。將三個(gè)輔助質(zhì)粒與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄載體共轉(zhuǎn)染能穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的BSR-T7/5細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72h收集細(xì)胞，反復(fù)凍融三次后接種9-11日齡SPF雞胚尿囊腔。收集24h

4、后死亡雞胚尿囊液，按OIE標(biāo)準(zhǔn)測(cè)其血凝(HA)效價(jià)，并用RT-PCR方法和基因測(cè)序鑒定是否為拯救病毒。結(jié)果顯示第一代尿囊液HA效價(jià)為28，傳代三次后，HA滴度上升為211。序列測(cè)定表明拯救病毒帶有引入的遺傳標(biāo)記，證明成功拯救出了具有感染性的GLa Sota C5株新城疫病毒。La Sota C5株反向遺傳操作平臺(tái)的建立為后續(xù)研究新城疫弱毒各結(jié)構(gòu)基因功能、開(kāi)發(fā)新型新城疫病毒疫苗等的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.嵌合新城疫ClassⅠ/C

5、lassⅡ弱毒疫苗候選株的構(gòu)建
　　RT-PCR方法分別擴(kuò)增出JS10株的M，F(xiàn)和HN基因，T-A克隆測(cè)序后經(jīng)PCR定點(diǎn)誘變連續(xù)缺失兩個(gè)酶切位點(diǎn)，再通過(guò)定向克隆構(gòu)建成中間質(zhì)粒至T-AB2中;使用兩端的PacⅠ和ASCⅠ單酶切位點(diǎn)將JS10株的M，F(xiàn)和HN基因整體與TVT-GLa Sota C5的相應(yīng)片段替換，從而構(gòu)建成三基因替換的重組轉(zhuǎn)錄載體TVT-GLa Sota C5M/F/HN。隨后將TVT-GLa Sota C5M/F/H

6、N與3個(gè)輔助質(zhì)粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，成功拯救出致弱的病毒GLa Sota C5M/F/HN，其血凝價(jià)210、雞胚半數(shù)感染量(EID50)為10102EID50/ml、雞胚最小致死劑量平均死亡時(shí)間(MDT)大于120h、腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)為022、靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)為0。經(jīng)SPF雞胚連續(xù)傳12代后未發(fā)現(xiàn)生物學(xué)特性改變。上述結(jié)果表明拯救的病毒毒力己明顯致弱、血凝價(jià)明顯升高、遺傳

7、穩(wěn)定性良好，是一個(gè)較為理想的疫苗候選株。
　　3.嵌合新城疫ClassⅠ/ClassⅡ弱毒疫苗候選株的免疫原性評(píng)價(jià)
　　為了比較GLa Sota C5M/F/HN與常用疫苗株La Sota的免疫原性差異，首先制備了GLa Sota C5M/F/HN和La Sota的高免血清并對(duì)不同基因型的NDV毒株對(duì)進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)。比較后發(fā)現(xiàn)，GLa Sota C5M/F/HN的抗血清對(duì)受試的強(qiáng)毒株的HI效價(jià)均高于La Sota的抗血

8、清。隨后選取了5株強(qiáng)毒與兩種血清分別進(jìn)行細(xì)胞交叉中和試驗(yàn)、雞胚交叉中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示GLa Sota C5M/F/HN的抗血清對(duì)所有強(qiáng)毒株的中和效價(jià)均比LaSota抗血清高3-5倍，對(duì)ClassⅠ強(qiáng)毒9a5b的中和效價(jià)是La Sota的10倍。最后將GLa Sota C5M/F/HN和La Sota分別免疫SPF雞，然后用ClassⅡ基因Ⅶ型強(qiáng)毒株ZJ1攻毒，Ⅸ強(qiáng)毒F48和ClassⅠ強(qiáng)毒9a5b攻毒比較兩者的免疫效果。結(jié)果顯示上述兩者

9、均能提供100％的保護(hù)，但GLa Sota C5M/F/HN能顯著降低免疫雞群攻毒后的排毒率。上述試驗(yàn)表明，GLa Sota C5M/F/HN有望成為新的弱毒疫苗候選株。
　　4.嵌合新城疫ClassⅠ/ClassⅡ弱毒疫苗候選株的黏膜免疫水平評(píng)價(jià)
　　選取60只SPF雛雞，隨機(jī)分為A、B、C3組，每組20只。A組和B組分別于7日齡時(shí)以滴鼻點(diǎn)眼方式免疫GLa Sota C5M/F/HN和La Sota，免疫劑量均為106EI