牛副流感病毒3型弱毒株對豚鼠的免疫原性研究及其致弱的分子基礎.pdf

1、牛副流感(Bovine parainfluenza)是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3，BPIV3)引起的一種急性接觸性傳染病，曾被稱為“船運熱”(Shipping fever)。發(fā)病牛食欲不振，精神萎靡，有流涕、流淚和咳嗽等呼吸道病癥狀，個別牛體溫升高，表現(xiàn)嚴重的牛發(fā)生呼吸困難。在運輸和寒冷等應激情況下可繼發(fā)細菌或支原體感染，如多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、牛支原體等，從而引起嚴重

2、的支氣管肺炎，導致牛呼吸道疾病綜合征(Bovinerespiratory disease complex，BRDC)，使死亡率大大增加。BRDC在全球范圍內對養(yǎng)牛業(yè)造成極大的危害，給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴重的經濟損失。病原學診斷和血清流行病學檢測均顯示BPIV3感染在我國流行較廣，因此我國目前迫切需要研發(fā)有效的BPIV3疫苗，以便對BPIV3感染實施有效的防控。
　　本研究將BPIV3 SD0835株在細胞上進行多次傳代，評估高代次病毒對豚

3、鼠致病性，篩選可以作為弱毒疫苗的候選毒株。首先將分離到的野毒SD0835株在MDBK細胞中進行傳代，連續(xù)進行了207次，以期達到降低其致病性的目的。我們選擇了3個高代次的病毒(P126、P151和P208)，研究它們對豚鼠的致病性，和野毒BPIV3 P2進行比較。結果顯示，高代次病毒對豚鼠的致病性降低，主要表現(xiàn)為高代次病毒感染豚鼠后導致動物發(fā)熱的數(shù)量減少，在肺臟中復制的滴度顯著下降，也不會導致肺臟出現(xiàn)顯著的眼觀病變，而且都可以誘導豚鼠產

4、生一定滴度的中和抗體。病理學組織觀察顯示P126和P151組豚鼠肺臟呈現(xiàn)肺泡間隔增寬等病變，和野毒組豚鼠肺臟病變非常相似。值得注意的是，P208代次毒感染豚鼠后沒有導致其死亡，肺臟病毒滴度減少，尤其是病理結果顯示該組豚鼠肺臟組織病理學病變程度與其他代次毒感染組相比減少很多，有的豚鼠肺臟沒有病變，接近空白對照組。綜合上述實驗獲得的結果，可以初步確定BPIV3 P208代次毒通過鼻內感染對于豚鼠是安全的，并且可以誘導其產生病毒中和抗體，該毒

5、株可以作為弱毒疫苗的候選毒株，因此后期可以將該毒株在本動物牛上進行免疫和攻毒實驗，以驗證其安全和有效性。
　　目前我國還沒有相關的BPIV3疫苗研究和商品化的疫苗。之前的研究已經表明，BPIV3經過細胞傳代后，其對豚鼠的致病性是顯著降低的，而且可以誘導機體產生中和抗體。因此我們將BPIV3 P208作為弱毒疫苗候選株，免疫豚鼠后攻毒，評價其安全性和有效性。結果顯示肌肉注射免疫豚鼠后，豚鼠直腸溫度正常也沒有產生任何臨床癥狀，說明該弱

6、毒疫苗株有較好的安全性;經過加強免疫后，豚鼠產生了高滴度的中和抗體，而且CD4+和CD8+T淋巴細胞的比例上升。攻毒后免疫的豚鼠沒有死亡的現(xiàn)象，呼吸道中幾乎分離不到病毒;而未免疫組的豚鼠有死亡的現(xiàn)象，呼吸道中病毒滴度較高，這說明該疫苗可以有效保護豚鼠免受強毒的攻擊。攻毒后我們也檢測了CD4+和CD8+T淋巴細胞的比例，發(fā)現(xiàn)免疫組和空白對照組豚鼠都出現(xiàn)不同比例的下降，空白對照組下降的比鍘更大?？傊珺PIV3的P208代次毒作為一個弱毒疫

7、苗候選株具有較大的應用前景和價值。
　　BPIV3通過細胞傳代后，其致病性降低，然而相關的分子基礎尚不清楚。我們測定了BPIV3 P2和數(shù)株高代次病毒的F和HN基因序列，測序結果顯示F和HN基因一共發(fā)生了14個有義突變，導致相應的14個氨基酸的改變，這些突變可能與BPIV3細胞傳代毒的致病性降低有關。而想要鑒定這些突變和毒力致弱的關系，構建病毒的感染性克隆是必不可少的。本研究將BPIV3分為7個節(jié)段，分別通過人工合成和RT-PCR

8、的方法獲得，通過合適的酶切位點進行拼接，構建了BPIV3全長基因組。同時也構建了表達核蛋白、磷蛋白和聚合酶蛋白的輔助質粒，免疫熒光顯示這些輔助質粒都能在哺乳類動物細胞中表達。將BPIV3全長基因組cDNA和3個輔助質粒共轉染MDBK細胞，進行了病毒的拯救，但現(xiàn)階段尚未拯救成功。
　　綜上所述，BPIV3經過207次細胞傳代之后，高代次病毒在細胞上繁殖能力和親本毒株相當。致病性實驗結果表明，高代次病毒尤其是P208毒株對豚鼠的致病力

9、顯著下降，主要表現(xiàn)在不會導致豚鼠死亡、病毒在肺臟中復制滴度減少、肺臟無眼觀病變、肺臟病理組織學變化也顯著減少，同時病毒仍然可以誘導動物產生中和性抗體，說明BPIV3 P208株可以作為疫苗候選株。將該疫苗候選株肌肉注射豚鼠，豚鼠沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀也沒有病毒血癥的發(fā)生，說明該疫苗株是安全的。該疫苗可以誘導動物機體產生體液免疫，還可以刺激淋巴細胞增殖。攻毒實驗表明免疫后的豚鼠可以抵抗親本毒的感染，表現(xiàn)在免疫組豚鼠沒有死亡，肺臟和氣管病毒