豬圓環(huán)病毒2型SH毒株增殖條件的優(yōu)化與免疫原性穩(wěn)定性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)有2種基因型，即PCV1和PCV2，其中PCV1不引起感染豬發(fā)病，而PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，它還與豬繁殖障礙(reproductive failure)、豬皮炎與腎病綜合癥(porcine dermatitis andnephropathy syndrome

2、，PDNS)和呼吸道疾病綜合癥(porcine respiratory diseasesyndrome，PRDS)有關(guān)，這些疾病被通稱為PCV2相關(guān)性疾病(PCVD)。目前，PCVD給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失，但我國尚無商品化PCV2疫苗。 PK-15細胞通常被用來體外增殖PCV2，但PCV2在其上增殖滴度較低且不穩(wěn)定，用300mM的D-氨基葡萄糖處理病毒可以增加PCV2復制，同時會使細胞發(fā)生退行性變化。為了獲得高滴度病毒，

3、本研究采用逐步降低細胞維持液中D-氨基葡萄糖的濃度，以篩選刺激病毒增殖的最佳濃度，并且通過優(yōu)化IPMA試驗條件，用于測定PCV2在PK-15細胞上的增殖情況。結(jié)果為，在維持液中加入1-2mMD-氨基葡萄糖既能有效的刺激病毒的復制，又不影響細胞的活性和傳代，接種PCV2后37℃培養(yǎng)72h病毒滴度最高。將PCV2連續(xù)傳代至第50代，收獲F20和F50病毒液，其TCID50達到106.25/ml。 為了進一步研究該病毒的免疫原性是否穩(wěn)

4、定，我們將F20和F50的兩個代次的病毒液用0.2％的甲醛37℃作用16h，然后取病毒液接種PK-15細胞，盲傳3代，用PCR方法檢測滅活效果，然后制成兩個不同代次的油乳劑滅活疫苗。取23頭30日齡PCV2陰性普通斷奶仔豬，隨機分為4組，第1，2，3組每組6頭，第四組5頭。第1組和第2組分別免疫兩個不同代次的疫苗，第3組為非免疫攻毒組；第4組為空白對照組。免疫組每頭豬肌肉注射2ml滅活疫苗，首免后第21天加強免疫1次。首免后每周采血，測

5、定ELISA抗體。除空白對照組外，其余豬在第42天攻毒PCV2，攻毒后4、7和11、19天用鑰匙孔血藍蛋白(KLH)和巰基乙酸培養(yǎng)基進行免疫刺激，隔離飼養(yǎng)觀察，30天后全部宰殺。攻毒后通過ELISA抗體、攻毒后臨床表現(xiàn)及體溫變化、剖解時的病理變化、相對日增重、病毒血癥及排毒情況等指標評價疫苗效果。結(jié)果為，兩個代次的疫苗均能產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，抗體水平相差不大。攻毒后，兩個免疫組的豬均無明顯臨床癥狀，而非免疫攻毒組有明顯的異常臨床表現(xiàn)，增

6、重緩慢，攻毒對照豬平均體溫高于免疫豬，空白對照豬在整個攻毒期中體溫始終保持正常。攻毒后免疫豬及空白對照豬平均體重均升高，而攻毒對照豬平均體重有所降低，且兩免疫組和空白對照組之間相對日增重差異不顯著。病毒血癥檢測表明，攻毒21天后未在免疫豬血清中檢測到PCV2，而在4頭攻毒對照豬血清中都檢測到了PCV2。并且兩個免疫組的豬的剖檢病理變化和病理組織學變化都明顯比非免疫攻毒組要輕。以上結(jié)果表明，PCV2-SH株具有穩(wěn)定的免疫原性，可以提供有效