豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)小鼠的免疫原性.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，是新興的豬病原體，自1998年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2是目前已知感染哺乳動(dòng)物最小的DNA病毒，基因組為單股環(huán)狀，約1.7kb大小。最初PCV2引起的相關(guān)疾病綜合癥，被稱為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)。隨著越來(lái)越多表現(xiàn)型的出現(xiàn)，如生殖障礙、腸道疾病和呼吸道癥狀等，才將PCV2引起的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病PCVAD。2003年以來(lái)，PCV2流行基因型從PCV2a向PCV

2、2b轉(zhuǎn)變，PCV2b基因型的患病率在全球急劇增加，且病情更為嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)已有以PCV2b為抗原的全病毒滅活苗投入市場(chǎng)使用，且有較好的免疫效果，但亞單位疫苗與其相比擁有安全性高、純度高、產(chǎn)量高等更多優(yōu)點(diǎn)，仍然是國(guó)內(nèi)PCV2疫苗研究的熱點(diǎn)。
　　本研究以pEGFP-C3載體及實(shí)驗(yàn)室2003年分離到的PCV2-HZ0201(PCV2b)毒株為模板，分別擴(kuò)增出GFP基因和ORF2基因，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將目的基因插入

3、pFastBac-Dual轉(zhuǎn)移載體的多克隆位點(diǎn)，成功構(gòu)建pFastBac-Dual-GFP-ORF2(在兩個(gè)啟動(dòng)子下游分別插入GFP基因和ORF2基因)和pFastBac-Dual-2ORF2(在兩個(gè)啟動(dòng)子下游都插入ORF2基因)重組轉(zhuǎn)移載體;將重組載體轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在Tn7轉(zhuǎn)座子的作用下與存在于感受態(tài)細(xì)胞中的桿狀病毒基因組發(fā)生轉(zhuǎn)座;經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定，獲得重組的穿梭載體rBacmid-GFP-ORF2和rBa

4、cmid-2ORF2;轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞收獲重組桿狀病毒rBac-GFP-ORF2和rBac-2ORF2。以GFP熒光蛋白作為指示蛋白來(lái)判斷重組桿狀病毒感染細(xì)胞的情況，獲得了高滴度的重組桿狀病毒rBac-2ORF2;以P2代重組桿狀病毒rBac-2ORF2不同的感染復(fù)數(shù)接種Sf9細(xì)胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)收樣，系統(tǒng)摸索出重組桿狀病毒最佳病毒擴(kuò)增條件為MOI值為0.5、感染Sf9細(xì)胞后144h收樣，進(jìn)一步確定Cap蛋白最佳表達(dá)條件為MOI值為2、感

5、染Sf9細(xì)胞后96h收樣。
　　以原核表達(dá)并純化的GST-dCap標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量檢測(cè)真核表達(dá)Cap蛋白濃度可達(dá)到10μg/mL以上;利用蔗糖密度梯度離心純化Cap蛋白，2％磷鎢酸負(fù)染后在電子顯微鏡下觀察到病毒樣顆粒的形成。
　　通過(guò)PCV2膠體金試紙條半定量檢測(cè)確定Cap蛋白抗原的免疫劑量，β-丙內(nèi)酯以15000滅活重組桿狀病毒，Montanide GEL01PR佐劑以5-20％乳化Cap蛋白。用制備的PCV2Cap蛋白免疫抗

6、原，并以ZJ/C株P(guān)CV2滅活疫苗作對(duì)照分組免疫BALB/C雌鼠。IFA檢測(cè)免疫后小鼠血清PCV2抗體效價(jià)、熒光定量PCR檢測(cè)攻毒后小鼠血清和脾臟組織中PCV2病毒載量來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性。小鼠血清抗體效價(jià)結(jié)果顯示Cap蛋白原液，5倍濃縮液免疫小鼠21d，28d均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)PCV2的抗體，其血清學(xué)轉(zhuǎn)陽(yáng)率可達(dá)8～10/10（IFA檢測(cè)血清抗體效價(jià)≥1∶400），濃縮5倍樣品免疫小鼠后產(chǎn)生血清抗體效價(jià)平均水平顯著高于Cap蛋白原液，

7、免疫28d后的血清抗體效價(jià)略高于免疫后21d，差別不顯著。熒光定量PCR結(jié)果顯示，免疫組小鼠脾臟組織中PCV2病毒載量顯著低于未免疫組，說(shuō)明Cap蛋白抗原可有效抵抗PCV2在小鼠脾臟組織中的復(fù)制;小鼠血清PCV2病毒載量結(jié)果顯示免疫后小鼠血清中病毒載量顯著低于未免疫組，病毒血癥發(fā)生的概率低。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，制備的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白免疫抗原能刺激小鼠產(chǎn)生針對(duì)PCV2的特異性抗體，有效抵抗病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，說(shuō)明該昆蟲細(xì)胞表達(dá)