豬圓環(huán)病毒2d亞型Cap蛋白(ΔNLS)在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)和鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovurus type2，PCV2）是豬腹瀉綜合征（PDS）、豬免疫缺陷綜合征（PIDS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）等多種疾病的主要病原。豬圓環(huán)病毒病已經(jīng)成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疾病之一，對于該病的防治，主要是以疫苗免疫為主。我國在疫苗方面的研究，主要是以滅活疫苗為主，但滅活疫苗生產(chǎn)周期普遍較長，病毒滴度不高，主要刺激動物體液免疫等缺點(diǎn)或許是導(dǎo)致PCV2不能

2、有效控制的原因所在。但在我國，豬圓環(huán)亞單位疫苗等新型疫苗卻相對較少，并且無論滅活苗還是亞單位疫苗，大都是基于PCV2a和PCV2b亞型。雖然PCV2b亞型在我國仍然是主要流行毒株，但是2014年之后的流行病學(xué)調(diào)查顯示，新興的PCV2d亞型已經(jīng)在廣東山東等部分省份流行，并且已經(jīng)成為這些省份的主要流行毒株，有學(xué)者推測，未來幾年P(guān)CV2d亞型有取代PCV2b亞型并成為我國主要流行毒株的趨勢，為有效控制該病，減少經(jīng)濟(jì)損失，所以研究基于PCV2d

3、亞型的亞單位疫苗是一項緊迫而艱巨的任務(wù)。本研究在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了PCV2d缺失核定位信號序列（ΔNLS）的Cap蛋白。
　　試驗(yàn)一 PCV2d亞型Cap蛋白基因（ΔNLS）克隆及序列分析
　　本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中公布的PCV2 Cap蛋白基因序列的保守區(qū)，設(shè)計并合成引物,從臨床PCV2疑似病料(淋巴結(jié))中擴(kuò)增去核定位信號序列的Cap蛋白基因，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，利用分子生物學(xué)軟件MegAlign對克隆基因序列的

4、核苷酸、氨基酸同源性以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行分析，采用Protean軟件對Cap蛋白克隆基因片段進(jìn)行抗原表位的預(yù)測分析，最后對該克隆毒株進(jìn)行毒力的預(yù)測分析。結(jié)果表明，該克隆基因序列與PCV2d亞型的氨基酸和核苷酸序列同源性最高分別100％和99.8%，而與其他亞型毒株的的氨基酸和核苷酸同源性分別為85.9%～94.2%和87.8%～94.1%；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示該毒株與 PCV2d亞型屬于同一個分枝，由此確定該克隆基因毒株屬于 PCV2d

5、亞型，命名為PCV2-SD；通過與商品化疫苗株的Cap蛋白抗原表位進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，該Cap蛋白克隆基因在約160aa-180aa位點(diǎn)處比商品化疫苗株多一處抗原表位；克隆基因毒株Cap蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)（N75aa/I76aa/T131aa）與 PCV2強(qiáng)致病性毒株一致，推測其屬于強(qiáng)致病性毒株。
　　試驗(yàn)二PCV2d亞型Cap蛋白基因（ΔNLS）重組桿狀病毒載體的構(gòu)建
　　本試驗(yàn)利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將試驗(yàn)一

6、擴(kuò)增的去核定位信號序列的Cap蛋白基因插入到供體載體pFastBac1的BamHI/XhoI位點(diǎn)處，雙酶切鑒定和PCR鑒定之后測序，并且對重組供體質(zhì)粒的測序結(jié)果和試驗(yàn)一的 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行比對。將測序正確的重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，對桿狀病毒重組穿梭桿粒進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明，該重組供體質(zhì)粒的測序結(jié)果與試驗(yàn)一的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果一致，沒有出現(xiàn)堿基的缺失或者突變，成功構(gòu)建桿狀病毒的重組供體質(zhì)粒（pFastB

7、ac1-PCV2d-cap），通過PCV2特異性引物和M13引物PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，成功構(gòu)建桿狀病毒重組穿梭桿粒（Bacmid-PCV2d-Cap），為后續(xù)轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)三PCV2d亞型Cap蛋白基因（ΔNLS）在Sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)和鑒定
　　本試驗(yàn)利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) Sf9昆蟲細(xì)胞，在細(xì)胞生長狀態(tài)良好，經(jīng)活細(xì)胞計數(shù)成活率在95%以上時，將試驗(yàn)二中構(gòu)建正確的重組穿梭桿粒Bacmid-PCV2d-C

8、ap轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞。培養(yǎng)幾天后，觀察重組桿狀病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測，并分別用豬圓環(huán)病毒2型陽性血清和鼠源的抗His單抗作為一抗進(jìn)行Western-blot鑒定，用豬圓環(huán)病毒陽性血清和熒光素標(biāo)記抗體羊抗豬IgG-FITC二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定。結(jié)果表明：Bacmid-PCV2d-Cap在 Sf9昆蟲細(xì)胞中成功包裝成桿狀病毒并引起細(xì)胞病變，重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞SDS-PAGE后在大約2

9、4KD處出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的蛋白條帶，而對照組沒有出現(xiàn)預(yù)期的蛋白條帶；Western blot顯示該蛋白可以與豬圓環(huán)病毒2型陽性血清和鼠源的抗His單抗反應(yīng)并在大約24KD處出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的特異性免疫印記條帶；間接免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組桿狀病毒感染的S f9昆蟲細(xì)胞中觀察到綠色的免疫熒光反應(yīng)，而對照組沒有出現(xiàn)免疫熒光。綜上說明，該Cap蛋白基因（ΔNLS）在Sf9昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)。
　　本試驗(yàn)利用Bac-to-Bac桿狀病