兩株新城疫病毒強毒致病性的比較研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的一種重要傳染性疾病，其病原為新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)。根據(jù)遺傳進化距離，NDV可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大分支，目前已知的ClassⅠ NDV自然分離株均為弱毒株。本實驗室保存的一株無毒力鴨源ClassⅠ NDVDuck/JS/10(HQ008337)，將該株病毒經(jīng)氣囊連續(xù)傳代10次后得到了變異株JS10-A10。經(jīng)測

2、定該變異株的MDT、ICPI、IVPI等毒力指標均符合強毒標準，其F蛋白裂解位點亦變?yōu)?12KRQKRF117。動物試驗發(fā)現(xiàn)，JS10-A10通過肌肉注射或靜脈注射途徑對雞的致死率均為100％，而通過滴鼻、點眼自然感染的途徑卻不能致死雞，這與已知的新城疫傳統(tǒng)強毒株的特性嚴重不符。為了解析該變異強毒株與傳統(tǒng)強毒株的致病性差異，我們選擇了NDV國際標準強毒株Herts/33與變異株JS10-A10分別從體內(nèi)、體外試驗以及生物信息學分析對兩者

3、的致病力進行了系統(tǒng)的分析和比較。
　　1.兩株新城疫病毒強毒細胞感染的比較試驗
　　分別使用JS10-A10和Herts/33在體外感染DF-1和脾淋巴細胞，比較了這兩株強毒在細胞水平上的致病性。在不同時間點分別檢測兩株病毒感染細胞后上清的病毒滴度，結(jié)果表明，Herts/33的滴度要比JS10-A10稍高，但經(jīng)統(tǒng)計后無明顯差異。兩株病毒感染脾淋巴細胞后，分別在6h、12h、18h和24h收集細胞樣品，檢測細胞因子（IFNα、

4、IFNβ、IFNγ、IL-1β、IL-6和IL-18）的表達情況。結(jié)果表明，JS10-A10和Herts/33在不同時間點誘導脾淋巴細胞表達細胞因子的變化趨勢基本一致，在mRNA的轉(zhuǎn)錄水平上無顯著差異。同時，JS10-A10和Herts/33誘導DF-1細胞以及脾淋巴細胞產(chǎn)生的凋亡水平均無顯著差異。此外，兩株病毒引起的細胞病變程度也進一步表明兩者在細胞水平的致病力相似。
　　2.兩株新城疫病毒強毒感染SPF雞的致病力差異分析

5、>　　JS10-A10和Herts/33分別通過滴鼻點眼和肌肉注射感染4周齡SPF雞，根據(jù)不同組織的病毒載量、病變程度、細胞因子表達量以及機體的排毒和抗體水平，比較兩株強毒株對雞致病力差異。JS10-A10滴鼻點眼感染組在第5天病毒滴度最高(103-104 ELD50)，但第7天開始病毒在組織的分布逐漸降低直至消失;而JS10-A10肌肉注射組和Herts/33感染組感染后病毒滴度不斷增加，直至雞死亡，且病毒量可達到106 ELD50。

6、JS10-A10和Herts/33通過滴鼻點眼途徑感染雞，取其脾、肺、腸、和氣管制作病理切片。結(jié)果表明，JS10-A10感染雞只有肺臟組織切片稍微出血，而Herts/33感染雞脾、肺、腸和氣管都有顯著病變，尤其肺臟大片出血。排毒結(jié)果顯示JS10-A10滴鼻點眼組在感染后第5天喉氣管、泄殖腔棉拭子病毒量最高，分別為101.8和101.6 TCID50;而經(jīng)同樣途徑攻毒的Herts/33在相同時間點的病毒量分別為103.5和103.9TCI

7、D50?？贵w水平檢測顯示JS10-A10滴鼻點眼組在第4天抗體中和效價為24.5，之后逐漸升高，在第12天達到27.96;Herts/33滴鼻點眼組在第3天出現(xiàn)抗體中和效價的峰值(22)，之后降低直至死亡。細胞因子表達量檢測顯示JS10-A10滴鼻點眼組能在短時間內(nèi)誘導較高水平的細胞因子，包括IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1β、IL-6、IL-18、Mx和PKR;而Herts/33滴鼻點眼組誘導的細胞因子表達水平顯著低于JS10-

8、A10，且表達量峰值出現(xiàn)的時間較晚?？傊?，JS10-A10通過滴鼻點眼能誘導機體在較早的時間產(chǎn)生高水平的細胞因子，以及較高水平的病毒中和抗體效價，有效的抑制了病毒在體內(nèi)組織的擴散和復制，直至將病毒清除。
　　3.兩株新城疫病毒強毒生物信息學分析及初步驗證
　　體內(nèi)試驗表明，JS10-A10滴鼻點眼途徑感染雞，其臟器的病毒含量比較低，但誘導的細胞因子水平比較高。我們猜測:兩株強毒①F蛋白的差異導致病毒在體內(nèi)復制過程中毒力發(fā)生改

9、變;②HN蛋白的差異導致病毒與受體結(jié)合的能力不同;③V蛋白的差異導致病毒拮抗細胞因子（尤其干擾素）的能力不同。針對以上推測，我們應(yīng)用DNAStar、MEGA、Clustal等軟件以及在線工具ESPript3.x、SWISS-MODEL，比對了JS10-A10和Herts/33的F、HN、V蛋白的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，并繪制遺傳進化樹，初步分析了兩株強毒株在遺傳信息學上的差異。結(jié)果表明，兩株病毒的F基因裂解位點均為強毒特征，JS10-A1

10、0 F蛋白第25位氨基酸不是半胱氨酸(C)，而是丙氨酸(A); Herts/33 HN蛋白第520位為堿性氨基酸R，而JS10-A10為S。此外JS10-A10 HN蛋白比Herts/33多14個氨基酸，這可能影響病毒與受體的結(jié)合能力;V蛋白氨基酸序列差異最大，而NDV的V蛋白具有拮抗干擾素的功能，這可能是導致兩株病毒誘導機體細胞因子（尤其干擾素）表達量差異的原因。通過遺傳信息學分析，本實驗進一步探究了兩株病毒HN蛋白受體結(jié)合能力的差異