應(yīng)用新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)—構(gòu)建NP、P表達(dá)質(zhì)粒.pdf

1、新城疫病毒NDV作為不分節(jié)段負(fù)鏈RNA動物病毒，具備很多作為疫苗載體的優(yōu)勢。在體內(nèi)，NDV載體可穩(wěn)定表達(dá)外源基因，其與同源的RNA病毒不發(fā)生重組；安全穩(wěn)定，成本低廉；弱毒株對人和動物無致病性；免疫接種途徑簡單；能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫、黏膜免疫及局部免疫。因而，新城疫病毒作為疫苗載體引起越來越多學(xué)者的關(guān)注，有很大的應(yīng)用前景。隨著反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，通過構(gòu)建感染性cDNA克隆拯救負(fù)鏈RNA病毒，不只在研究病毒蛋白功能和基因作用元

2、件提供了更好的方法，也實(shí)現(xiàn)了負(fù)鏈RNA病毒作為載體表達(dá)外源基因。在NDV反向遺傳操作系統(tǒng)中，新城疫病毒的核衣殼蛋白NP必須與操縱RNA合成的輔助蛋白相互作用，才能完成RNA的合成。在L蛋白和P蛋白輔助下，NP與病毒的基因組RNA包裝成感染性的核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)，從而進(jìn)行NDV的轉(zhuǎn)錄和翻譯，啟動NDV的復(fù)制。 本研究選用新城疫病毒弱毒株LaSota疫苗株，將其感染敏感細(xì)胞Vero細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，用Trizol法

3、提取細(xì)胞的總RNA。用分別引入XhoI、EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的兩對引物通過兩步法分別對NP、P基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到了大小與實(shí)際相符的兩個(gè)基因片段。將所得的結(jié)果加A反應(yīng)后，與pGEM-T easy載體連接、轉(zhuǎn)化、克隆，測序。得到含有兩個(gè)基因片段的重組質(zhì)粒。用Xhol I、EcoR I分別將NP、P片段在T載體上酶切下來，與真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)連接，轉(zhuǎn)化，克隆后提取質(zhì)粒，命名為pcDNA3．1(+)-NP、ocD

4、NA3．1(+)-P。通過PCR、酶切及測序驗(yàn)證克隆正確。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293、BHK-21細(xì)胞中，72小時(shí)后，用RT-PCR法檢測兩個(gè)基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果表明兩個(gè)基因分別在兩個(gè)細(xì)胞中所得的四個(gè)樣本NP-293、NP-BHK-21、P-293、P-BHK-21得到了有效的轉(zhuǎn)錄。用免疫酶法初步地檢測兩個(gè)基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況，DAB染色后可見，與正常的293及BHK-21細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞部分為陽性的褐色細(xì)胞，可初步認(rèn)定

5、轉(zhuǎn)染成功。用WesternBlot方法可精確地鑒定兩種蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況，經(jīng)SDS-PAGE膠電泳后轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western Blot檢測，其中P蛋白的大小約為42．3KD，NP蛋白的大小約為53KD，經(jīng)DAB染色后可見清晰褐色條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果基本相符，說明pcDNA3．1(+)-NP、pcDNA3．1(+)-P表達(dá)載體構(gòu)建成功。本研究成功地表達(dá)了新城疫病毒LaSota株完整的NP、P基因片段，并利用RT-PCR、免疫酶法