應用新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)—構建NP、P表達質粒.pdf

1、新城疫病毒NDV作為不分節(jié)段負鏈RNA動物病毒，具備很多作為疫苗載體的優(yōu)勢。在體內，NDV載體可穩(wěn)定表達外源基因，其與同源的RNA病毒不發(fā)生重組；安全穩(wěn)定，成本低廉；弱毒株對人和動物無致病性；免疫接種途徑簡單；能夠誘導機體產生良好的體液免疫、黏膜免疫及局部免疫。因而，新城疫病毒作為疫苗載體引起越來越多學者的關注，有很大的應用前景。隨著反向遺傳操作技術的發(fā)展，通過構建感染性cDNA克隆拯救負鏈RNA病毒，不只在研究病毒蛋白功能和基因作用元

2、件提供了更好的方法，也實現(xiàn)了負鏈RNA病毒作為載體表達外源基因。在NDV反向遺傳操作系統(tǒng)中，新城疫病毒的核衣殼蛋白NP必須與操縱RNA合成的輔助蛋白相互作用，才能完成RNA的合成。在L蛋白和P蛋白輔助下，NP與病毒的基因組RNA包裝成感染性的核糖核蛋白復合體(RNP)，從而進行NDV的轉錄和翻譯，啟動NDV的復制。 本研究選用新城疫病毒弱毒株LaSota疫苗株，將其感染敏感細胞Vero細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變后，用Trizol法

3、提取細胞的總RNA。用分別引入XhoI、EcoR I兩個酶切位點的兩對引物通過兩步法分別對NP、P基因進行RT-PCR擴增，得到了大小與實際相符的兩個基因片段。將所得的結果加A反應后，與pGEM-T easy載體連接、轉化、克隆，測序。得到含有兩個基因片段的重組質粒。用Xhol I、EcoR I分別將NP、P片段在T載體上酶切下來，與真核表達載體pcDNA3．1(+)連接，轉化，克隆后提取質粒，命名為pcDNA3．1(+)-NP、ocD

4、NA3．1(+)-P。通過PCR、酶切及測序驗證克隆正確。將重組質粒分別轉染到293、BHK-21細胞中，72小時后，用RT-PCR法檢測兩個基因在細胞中的轉錄情況，結果表明兩個基因分別在兩個細胞中所得的四個樣本NP-293、NP-BHK-21、P-293、P-BHK-21得到了有效的轉錄。用免疫酶法初步地檢測兩個基因在細胞中的表達情況，DAB染色后可見，與正常的293及BHK-21細胞比較，轉染后的細胞部分為陽性的褐色細胞，可初步認定

5、轉染成功。用WesternBlot方法可精確地鑒定兩種蛋白在兩種細胞中的表達情況，經SDS-PAGE膠電泳后轉膜，進行Western Blot檢測，其中P蛋白的大小約為42．3KD，NP蛋白的大小約為53KD，經DAB染色后可見清晰褐色條帶，其大小與預期結果基本相符，說明pcDNA3．1(+)-NP、pcDNA3．1(+)-P表達載體構建成功。本研究成功地表達了新城疫病毒LaSota株完整的NP、P基因片段，并利用RT-PCR、免疫酶法