新城疫病毒F基因乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastl disease virus,NDV)所致的一種高度接觸性的傳染病,能引起雞、火雞、鴨、鴿子和鸚鵡等多種禽類的感染和死亡,給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失,因此國際獸疫局將其定為Ⅰ類傳染病。目前,對(duì)該病的防制仍以疫苗免疫為主。但傳統(tǒng)的疫苗存在著價(jià)格昂貴,操作繁瑣,免疫保護(hù)期不長,免疫不全以及毒力返強(qiáng)等問題。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,現(xiàn)已明確F蛋白是NDV的主要

2、保護(hù)性抗原之一,在疫苗的研制中具有重要的意義。 本實(shí)驗(yàn)選擇乳酸菌作為受體菌株表達(dá)外源基因F,即可將乳酸菌的益生功能和外源基因的特異性免疫相結(jié)合,從而研制新城疫病毒F基因工程乳酸菌。目的在于為開發(fā)研制預(yù)防新城疫毒病的基因工程乳酸菌口服疫苗奠定基礎(chǔ)。 在本研究中,用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù),從NDV的總RNA中擴(kuò)增了1662bp的F基因。通過T4 DNA連接酶將其直接連接于克隆質(zhì)粒載體pMD-18-T中,轉(zhuǎn)化

3、至受體菌JM109中,通過質(zhì)粒提取、酶切鑒定、PCR鑒定、序列測定,證明重組質(zhì)粒pMD-18-T-F中含有NDV F基因。經(jīng)氨基酸序列分析,表明克隆了NDV的主要保護(hù)性抗原F全基因的抗原表位區(qū)。然后,將NDV主要保護(hù)性抗原F克隆至可在大腸桿菌和乳酸菌中穿梭表達(dá)的具有紅霉素和胸苷酸基因的雙標(biāo)記表達(dá)載體。經(jīng)過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化條件,將重組質(zhì)粒pW425et-F轉(zhuǎn)化到乳酸菌受體菌中,通過乳酸菌質(zhì)粒的提取,酶切分析和PCR方法鑒定陽性克隆質(zhì)粒。將篩選好

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