雞IL-18變構(gòu)基因與新城疫病毒HN基因融合表達載體的構(gòu)建及體外抗馬立克病腫瘤細胞的研究.pdf

1、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)是一種溶癌病毒，可在腫瘤細胞內(nèi)增殖、抑制并裂解腫瘤細胞。研究發(fā)現(xiàn)，NDV的包膜糖蛋白血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)基因是NDV抗腫瘤的功能性基因，是NDV抗腫瘤作用的重要分子基礎(chǔ)。IL-18具有明顯的抗腫瘤作用，在腫瘤治療和腫瘤基因治療方面具有潛在的應(yīng)用前景。為探討刪基因及IL-18基因融合后抗腫瘤作用及其機制，本研究分別

2、構(gòu)建了HN基因、ChMIL-18基因及HN基因和ChMIL-18基因融合后的重組表達載體pPICZαA-HN、pPICZαA-ChMIL18和pPICZαA-HN-ChMIL18，經(jīng)誘導(dǎo)表達后，其目的蛋白均具生物學(xué)活性，進而以雞馬立克病腫瘤細胞系-MSB-1為體外研究對象，對MSB-1細胞的增殖抑制作用及其機制等方面進行了初步研究，結(jié)果表明，HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均可抑制腫瘤細胞生長，HN-ChMIL18融合蛋白對細胞抑

3、制作用明顯強與HN蛋白，其原因可能是ChMIL-18蛋白對HN蛋白致腫瘤細胞凋亡有增強作用，而ChMIL-18蛋白雖具有淋巴細胞增殖活性，但對腫瘤細胞無明顯的抑制作用，其為進一步研究HN基因和ChMIL-18基因融合蛋白體內(nèi)抗馬立克腫瘤奠定了基礎(chǔ)，具有重要的理論和實際意義。 1.目的基因的獲得及生物信息學(xué)分析 1.1ChMIL-18目的基因的獲得根據(jù)Genbank中雞IL-18成熟蛋白基因序列設(shè)計一對特異性引物，利用RT

4、-PCR技術(shù)，從外周血淋巴細胞中擴增到了雞IL-18成熟蛋白基因全序列，將其克隆至pMD18-T載體并測序，對測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：序列全長為507bp，其理論分子量為19.5KD，等電點為6.36，無糖基化位點，具抗原性等。為提高具有生物活性的ChIL-18的表達量，應(yīng)用反向長距離PCR定點突變技術(shù)對雞IL-18成熟蛋白基因第28位和第37位的Arg密碼子進行同義突變，將畢赤酵母中低頻密碼子CGA突變?yōu)楦哳l密碼子AGA

5、，獲得突變體pMD18-T-ChMIL18，將其轉(zhuǎn)化至E.coliJM109中，抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，進行測序，測序結(jié)果與原ChIL18比對表明突變成功，獲得了目的突變基因。 1.2HN基因的獲得應(yīng)用RT-PCR方法對NDVLaSota株HN基因進行了擴增與克隆，得到大小約為1.7Kb的LaSota株HN基因，與Genbank中登錄的HN基因大小一致；擴增序列經(jīng)PCR、酶切鑒定及序列測定證實與預(yù)計結(jié)果相符；用DNASt

6、ar及在線分析軟件對HN基因的生物信息學(xué)進行分析，其結(jié)果為：HN基因共577個氨基酸，理論分子量為63.0KD，等電點為7.54，12個半胱氨酸殘基，5個N-糖基化位點，與B1、Clone30、LaSota、JI1和HB92核苷酸同源性在98.8％-99.8％，氨基酸同源性分別為98.896-99.5％。 1.3HN-ChMIL18融合基因的獲得根據(jù)表達載體pPICZαA及克隆載體pBluescriptSK+(pBsSK+)的多

7、克隆位點，設(shè)計HN基因的引物(含柔性接頭)，在兩端分別引入KpnI和BamHI酶切位點，以及變構(gòu)體MIL-18引物(含柔性接頭)，在兩端分別引入BamHI和NotI酶切位點。分別以pMD18-T-HN、pMD18-T-ChMIL18為模板擴增得到融合基因片段HNf和ChMIL-18f，并克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建了克隆載體pMD18-T-HNf、pMD18-T-ChMIL18f。 重組質(zhì)粒pMD18-T-HNf和pBSSK+

8、分別用/KpnI/BamHI雙酶切，片段回收產(chǎn)物按適當(dāng)比例連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒命名為pBSSK+-HN。然后，重組質(zhì)粒pMD18-T-ChMIL18f和pBSSK++HN分別用BamHI、NotI雙酶切，回收產(chǎn)物按適當(dāng)比例連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒鑒定正確后命名為pBSSK+-HN-ChMIL18，經(jīng)酶切、PCR鑒定及序列比對表明獲得了目的基因HN-ChMIL18。 2.

9、表達載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達及表達產(chǎn)物的活性檢測 2.1表達載體pPICZαA-ChMIL18的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達及表達產(chǎn)物的活性檢測質(zhì)粒pMD18-T-ChMIL18和pPICZαA分別用EcoRI、KpnI雙酶切，電泳回收純化ChMIL18和pPICZαA雙酶切產(chǎn)物，按適當(dāng)比例進行連接，轉(zhuǎn)化到E.coliJM109感受態(tài)細胞中，鑒定結(jié)果表明獲得了重組質(zhì)粒pPICZαA-ChMIL18。將重組質(zhì)粒pPICZαA-ChMIL18用Sac

10、I酶切線性化，電脈沖方法克隆至PichiaPastoris(P.Pastotris)X-33感受態(tài)細胞中，經(jīng)高抗性篩選、PCR鑒定結(jié)果表明pPICZαA-ChMIL18已整合入P.PastorisX-33染色體中，用1％甲醇對其進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE結(jié)果表明目的蛋白存在于上清中，分子量約為23KD，Westernblot結(jié)果表明表達產(chǎn)物具良好的免疫原性，淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果表明ChMIL18具有促淋巴細胞增殖的活性。 2

11、.2表達載體pPICZαA-HN的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達及表達產(chǎn)物的活性檢測質(zhì)粒pPICZαA和重組質(zhì)粒pMD18-T-HN分別用KpnI/NotI雙酶切，電泳回收純化HN和pPICZαA片段，按適當(dāng)?shù)谋壤M行連接，克隆至E.coliJM109感受態(tài)細胞中，經(jīng)酶切及PCR鑒定，結(jié)果表明獲得了重組質(zhì)粒pPICZαA-HN。重組質(zhì)粒pPICZαA-HN用SacI酶切線性化，電擊轉(zhuǎn)化入P.PastorisX-33感受態(tài)細胞中，經(jīng)高抗性篩選、PCR鑒定

12、證明pPICZαA-HN已整合入X-33的染色體上，對其進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE、Western-blot及血凝試驗結(jié)果表明上清中有目的蛋白，其分子量約為97KD，且具良好的免疫原性和凝集紅細胞的活性。 2.3表達載體pPICZαA-HN-ChMIL18的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達及表達產(chǎn)物的活性檢測質(zhì)粒pBSSK+-HN-ChMIL18和pPICZαA分別用KpnI/NotI雙酶切，電泳回收HN-ChMIL18與pPICZαA雙酶切

13、產(chǎn)物并純化，按適當(dāng)比例進行連接，克隆至E.coliJM109感受態(tài)細胞，酶切及PCR鑒定結(jié)果表明獲得了重組質(zhì)粒pPICZαA-HN-ChMIL18。重組質(zhì)粒pPICZαA-HN-ChMIL18用SacI酶切線性化后，電擊轉(zhuǎn)化入酵母菌X-33感受態(tài)細胞中，高抗性篩選和PCR鑒定結(jié)果表明pPICZαA-HN-ChMIL18已整合入X-33染色體上，對其進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE、Western-blot結(jié)果表明目的蛋白為分泌性表達，分子

14、量約為103KD，具良好的免疫原性，同時，淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、血凝試驗證明表達產(chǎn)物具有促進淋巴細胞增殖和凝集紅細胞的活性。 3.體外抗馬立克腫瘤細胞系MSB-1的初步研究 以馬立克氏病腫瘤細胞系-MSB-1為體外研究對象，分別將ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白與MSB-1細胞共培養(yǎng)后，通過增殖抑制試驗、瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞儀等方法探討其抑制機制，MTT結(jié)果表明HN蛋白、HN-ChMIL18融

15、合蛋白對MSB-1細胞的增殖有抑制作用，并呈劑量相關(guān)性，而ChMIL-18蛋白無抑制作用；瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，ChMI-18蛋白、刪蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白與MSB-1細胞共培養(yǎng)一段時間后，HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均出現(xiàn)DNA斷裂現(xiàn)象；ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白與MSB-1細胞共培養(yǎng)后，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均引起MSB-1細胞出現(xiàn)了凋亡，而