乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的初步構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱，廣泛存在于自然界中，被公認(rèn)為是安全的食品級(jí)(generallvregarded as safe，GRAS)微生物。黏膜系統(tǒng)是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，利用細(xì)菌載體接種黏膜表面誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)水平的有效免疫應(yīng)答，是有效預(yù)防從黏膜入侵傳染因子的方法之一。減毒活菌疫苗不適用于所有人群，并有恢復(fù)毒力的危險(xiǎn)；而用乳酸菌作為活菌疫苗載

2、體能有效的避免以上問(wèn)題。利用乳酸菌作為活菌疫苗載體能順利通過(guò)胃到達(dá)腸黏膜，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有望成為新型疫苗。在乳酸菌中，可以作為活菌疫苗載體有乳桿菌(Lactobacillus)和乳球菌(Lactococcus)。用乳桿菌作為活菌載體表達(dá)外源抗原時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生免疫耐受。而乳球菌不是人體腸道的正常菌，不會(huì)產(chǎn)生免疫耐受。 國(guó)內(nèi)外有用乳酸菌進(jìn)行重組蛋白表達(dá)和活菌疫苗研究的報(bào)道，但缺乏系統(tǒng)研究。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少。 用增強(qiáng)型

3、綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)作為報(bào)告基因，比較了兩種啟動(dòng)子的啟動(dòng)效果。酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子P170受到自身代謝產(chǎn)生的H<'+>和生長(zhǎng)量的誘導(dǎo)，即在pH低于6.5和在穩(wěn)定期時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)，不需要額外加入誘導(dǎo)物，宿主菌的菌體生長(zhǎng)期和表達(dá)蛋白的生產(chǎn)期分開(kāi)。P<,nisA>啟動(dòng)子是一個(gè)誘導(dǎo)效果很強(qiáng)的啟動(dòng)子，受到NisK和NisR的調(diào)控。nisin是一種安全的食品添加劑，其作為誘導(dǎo)物時(shí)的濃度在

4、一定范圍內(nèi)與外源蛋白表達(dá)量呈正比例關(guān)系，容易控制。分別將egfp放在P170和P<,nisA>啟動(dòng)子后構(gòu)建胞內(nèi)和胞外表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌(Lc．lactis)中，用SDS-PAGE檢測(cè)及熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)無(wú)論是胞內(nèi)表達(dá)還是胞外表達(dá)，P<,nisA>啟動(dòng)子的啟動(dòng)效果均強(qiáng)于P170啟動(dòng)效果。 將pα置于P<,nisA>啟動(dòng)子后構(gòu)建胞內(nèi)和胞外表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化入Lc．lactisl．2030中。用ELISA檢測(cè)到PA的胞外表達(dá)情

5、況，在培養(yǎng)12小時(shí)后檢測(cè)到PA的表達(dá)，在16小時(shí)后趨于穩(wěn)定：Western Blotting檢測(cè)到胞內(nèi)PA的表達(dá)，用SDS-PAGE檢測(cè)PA隨時(shí)間變化的關(guān)系，加入誘導(dǎo)物后4小時(shí)有表達(dá)，在16小時(shí)候趨于穩(wěn)定。胞內(nèi)表達(dá)效果較胞外表達(dá)效果好。同時(shí)構(gòu)建了在PA的N端和C端含6個(gè)His-tag的表達(dá)載體。為了避免抗性基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和質(zhì)粒的不穩(wěn)定行，利用組氨醇磷酸化酶基因(hisB)作為同源交換序列，以pMD18-T為基礎(chǔ)構(gòu)建了在Lc．lacti

6、s中的自殺型整合載體pHEC。隨后將P<,nisA>啟動(dòng)子和pa插入hisB正中間構(gòu)建了含pa的自殺整合型載體pHEC-Pnis-PA，不含分泌信號(hào)肽基因，表達(dá)的PA不分泌到胞外。隨后篩選得到了單交換突變體Lc．lactisl．2030S和雙交換突變體Lc．lactisl．2030D，用SDS-PAGE檢測(cè)有PA的表達(dá)。同樣的用乳桿菌表達(dá)載體在植物乳桿菌(Lb．plantarum)中表達(dá)了N端含有6個(gè)his標(biāo)簽的PA。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果