高積累谷胱甘肽乳酸菌的分離、鑒定及重組工程菌的構(gòu)建.pdf

1、谷胱甘肽(GSH)具有提高機(jī)體免疫力清除體內(nèi)自由基、解毒等重要生理功能，并在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白修復(fù)與合成、DNA合成等方面發(fā)揮著巨大作用。因而，篩選富含GSH菌株、挖掘新型雙功能GSH合成酶(GshF)、構(gòu)建高產(chǎn)GSH菌株，尤其是產(chǎn)GSH的乳酸菌工程菌株具有重要應(yīng)用意義和經(jīng)濟(jì)價值。
　　本研究以構(gòu)建產(chǎn)GSH的益生性乳酸菌為目標(biāo)，篩選得到了一株可富集GSH的乳酸菌，并通過微生物生理生化分析、分子生物學(xué)方法進(jìn)行了菌株鑒定，通過克隆和表達(dá)

2、該菌株潛在的谷胱甘肽合成酶基因驗(yàn)證了其潛在的GSH合成酶的功能，最后以該菌株為宿主構(gòu)建了一株具備GSH合成能力的乳酸菌工程菌株。主要結(jié)果如下:
　　以內(nèi)蒙古奶酪等為目標(biāo)菌源，采用平板分離獲取了一株富含GSH的乳酸菌，其胞內(nèi)GSH含量高達(dá)6.14 mg·g-1（細(xì)胞干重）。進(jìn)一步通過菌株培養(yǎng)特征、生理生化指標(biāo)考察及16S rDNA等技術(shù)，鑒定其為副干酪乳桿菌，并命名為Lactobacillus paracasei LHA4。

3、　　為驗(yàn)證L.paracasei LHA4中潛在的GSH合成酶的功能，克隆獲取了其的潛在的gshF，并分別構(gòu)建了基于大腸桿菌及乳酸乳球菌的異源原核表達(dá)系統(tǒng)。序列分析表明 GshFLp序列與Pasteurella multocida2000及Streptococcusthermophilus CNRZ1066的GshF序列相似性分別僅為27％與25％;且GshFLp較具有催化活性的GshF短100余個氨基酸。為驗(yàn)證GshFLp功能，分別以

4、pET-28a(+)及pNZ8148為表達(dá)載體并構(gòu)建了重組表達(dá)工程菌株E.coli BL21/pET28a-gshFLp和L.lactis NZ9000/pNZ8148-gshFLp。實(shí)現(xiàn)了GshFLp于E.coli BL21和L.lactisNZ9000胞內(nèi)的可溶性表達(dá)。然而，純化于E.coli BL21的電泳純蛋白和L.lactisNZ9000/pNZ8148-gshFLp的粗酶液均未檢測到相應(yīng)酶活;同時，結(jié)合L.paracasei

5、LHA4的粗酶液亦未能在含有ATP條件下將Glu、Gly和Cys三種前體氨基酸轉(zhuǎn)化為GSH的現(xiàn)象，我們認(rèn)為，依據(jù)生物信息學(xué)所推測的潛在的GshFLp不具備合成GSH的能力。
　　為進(jìn)一步提升菌株L.paracasei LHA4胞內(nèi)GSH含量，以本研究室分離的一株具備GSH合成能力的Streptococcus thermophilus基因組為模板，克隆獲取該菌株雙功能GSH合成酶基因gshFSt，將其構(gòu)建至乳酸菌組成型表達(dá)載體pMG