青貯用纖維素分解工程乳酸菌的構(gòu)建.pdf

1、青貯是一種以新鮮的青綠飼料為原料，利用植物表面自然附生的乳酸菌，在密閉條件下，通過厭氧發(fā)酵，將植物表面的可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，導(dǎo)致飼料pH值降低，來抑制腐敗微生物菌群的生長繁殖，從而達(dá)到保持作物的營養(yǎng)特性的目的的技術(shù)。其有著其獨(dú)特的，其它種類飼料所無法比及的優(yōu)點(diǎn)：青貯飼料能夠較好的保存原料的蛋白、可溶性碳水化合物、小分子維生素和礦物質(zhì)的含量，便于牲畜吸收利用，提高青貯飼料的消化率的同時(shí)也提高了生產(chǎn)率；其適口性好，利于牲畜采食；青

2、貯過程中有益微生物的活動(dòng)，如乳酸菌產(chǎn)生的乳酸可以殺死很多牲畜的病害微生物、寄生蟲卵等。人為的添加一些工程乳酸菌作為青貯劑，能促進(jìn)有益微生物的活動(dòng)，可以進(jìn)一步降解原料中的纖維素成分轉(zhuǎn)化為小分子的單糖、寡糖或者低聚糖，便于牲畜吸收利用，提高青貯飼料的消化率。
　　 本實(shí)驗(yàn)以在模式大腸桿菌菌株Rosetta和乳酸菌菌株NZ9000中表達(dá)瑞氏木霉（Trichodermareesei）CBHⅡ基因的方法，得到兩株能表達(dá)外源纖維素酶的工程菌

3、；然后，利用REAL-TIMERT-PCR對(duì)外源基因在工程乳酸菌中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)進(jìn)行準(zhǔn)確的絕對(duì)定量分析，建立一種新的REAL-TIMERT-PCR分析方法，同時(shí)利用pNPC法測定了工程菌的酶活力，為構(gòu)建青貯用工程乳酸菌提供了一種技術(shù)路線和對(duì)其進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)的方法。
　　 通過實(shí)驗(yàn)得到如下結(jié)果：將纖維素酶基因CBHⅡ與表達(dá)載體pET30a重組，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pETCBH。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌，獲得了重組菌株Rose

4、tta（pETCBH）；利用IPTG誘導(dǎo)重組菌株Rosetta（pETCBH），并通過pNPC法測定了重組纖維素酶CBHⅡ的活性，其活性為2.677U/mL。將纖維素酶基因CBHⅡ與表達(dá)載體pNZ8148重組，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pNZCBH。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化NZ9000宿主菌，獲得了重組菌株NZ9000（pNZCBH）。建立了利用基于DNA扣除法的REAL-TIMERTPcR對(duì)基因進(jìn)行定量分析的方法，該方法平行性好，可信度高，可以在轉(zhuǎn)錄水平分