新型乳酸菌表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及其潛在應(yīng)用研究.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文新型乳酸菌表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及其潛在應(yīng)用研究姓名：胡淑敏申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師：孔健20110419山東大學(xué)博士學(xué)位論文56kDa的表層蛋白。根據(jù)已報道的S層蛋白基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增得到菌株K243表層蛋白的保守序列：再根據(jù)保守序列設(shè)計引物，利用LigationanchoredPCR擴(kuò)增獲得菌株K243表層蛋白基因(s邶)的全長序列，大小為1，323bp，編碼440個氨基酸，經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)與

2、如c幻6口cf批cr啪忽岱的S層蛋白同源性達(dá)95％。2利用s層蛋白細(xì)胞壁錨定域構(gòu)建乳酸菌表面展示體系及靶向表達(dá)系統(tǒng)在芽孢桿菌中已成功利用S層蛋白將目的蛋白展示在細(xì)胞表面，但乳桿菌中這部分的研究相對較少，因此本文探討和分析S層蛋白作為乳酸菌錨定基序的潛在應(yīng)用價值。序列分析發(fā)現(xiàn)三6∥卸以f淞lQ43表層蛋白(S1pB)的C端序列(LcsB)和￡6口cf如礎(chǔ)f，淞及三及c，卸口舭，表層蛋白的細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域有高度同源性，暗示LcsB可作為乳酸

3、菌表面展示外源蛋白的分子載體。為了驗證LcsB作為錨定基序構(gòu)建乳酸菌表面展示系統(tǒng)的可行性，本文將綠色熒光蛋白基因(g彥)和zc姐基因進(jìn)行融合，構(gòu)建大腸桿菌融合表達(dá)載體pETg邱1csB，并導(dǎo)入到大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白GFPLcsB。將純化后的融合蛋白與不同乳酸菌細(xì)胞孵育后，熒光顯微鏡觀察在三6如舾MPc砌、工66陀協(xié)、三6五P～e“c淞、三及joh琊omi、Lbcnspn譏S、SlreptococcHsthermophilus、Lnct

4、ococ懈tactis幫Lbs口廳Ⅷ一淞細(xì)胞表面均具有GFP綠色熒光，表明在LcsB引導(dǎo)下GFP蛋白被展示在乳酸菌細(xì)胞表面。為闡明LcsB在乳酸菌細(xì)胞壁上的作用位點，對乳酸菌細(xì)胞做不同預(yù)處理，分析不同處理對GFPLcsB結(jié)合能力的影響，結(jié)果表明SDS處理可以提高GFPLcsB的結(jié)合能力，而TCA處理降低GFPLcsB在三6如脅Mec砌細(xì)胞表面的結(jié)合量，表明LcsB在細(xì)胞壁表面的結(jié)合位點是磷壁酸，每個細(xì)胞大約結(jié)合107個GFPLcsB蛋白