鐵結(jié)合蛋白進(jìn)化分析，乳酸菌表面展示系統(tǒng)構(gòu)建和產(chǎn)乙醇耐受性研究.pdf

1、鐵作為生物有機(jī)體中必需的微量元素之一，在細(xì)胞代謝和生物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用，比如，體內(nèi)氧的運(yùn)輸，電子的傳遞，細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖，但是，機(jī)體內(nèi)鐵過量會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)自由基提升，從而引起蛋白和DNA的氧化損害，造成細(xì)胞和組織的死亡。生物體內(nèi)維持鐵平衡的蛋白家族主要是鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的乳鐵蛋白同時(shí)作為抗菌活性肽在機(jī)體的免疫方面起著至關(guān)重要的作用。本研究從了解鐵蛋白家族和轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的進(jìn)化及乳鐵蛋白在家族進(jìn)化過程中的產(chǎn)生

2、和地位入手，將乳鐵蛋白作為抗菌活性肽在食品級(jí)乳酸菌中進(jìn)行表面表達(dá)，以期獲得能夠應(yīng)用于飼料添加劑的高效活性益生菌，同時(shí)還對(duì)乳酸菌作為產(chǎn)乙醇菌耐受木質(zhì)纖維水解液抑制物進(jìn)行了探索。主要研究結(jié)果如下:
　　1.鐵蛋白家族的進(jìn)化
　　鐵蛋白家族成員廣泛分布在生物界中，而最典型的鐵蛋白作為看家基因，在動(dòng)物、植物和微生物界都有發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)選取了248個(gè)來自病毒、古菌、細(xì)菌和真核生物的1181條蛋白序列進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)鐵蛋白基因在哺乳動(dòng)物

3、和雙子葉植物中大量存在，真菌中由于有其它鐵平衡系統(tǒng)而很少存在，細(xì)菌、古菌中的鐵蛋白基因也很可觀;其中在原核生物中有3中類型的鐵蛋白亞家族存在，而在真核生物中，只有典型的鐵蛋白亞家族存在，但是它是由多種類型的亞基組成;特征序列模體的分析表明，維持鐵結(jié)合和釋放功能的氨基酸殘基位點(diǎn)在生物進(jìn)化中是保守存在的，同時(shí)每個(gè)亞家族和亞基類型的特征序列模體是可區(qū)分的，特別是在植物鐵蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)辨識(shí)度很高的特征模體;鐵蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，相同亞家

4、族或亞基的鐵蛋白成員在進(jìn)化樹上是簇成一個(gè)進(jìn)化分支的，不同的亞家族或亞基產(chǎn)生的主要原因是基因復(fù)制事件的發(fā)生，同時(shí)基因漂移和基因丟失也是產(chǎn)生家族新成員的因素。
　　2.轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的進(jìn)化
　　轉(zhuǎn)鐵蛋白家族作為轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子維持鐵平衡的重要蛋白家族主要存在于動(dòng)物中，同時(shí)在綠藻中也有發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)選取了具有代表性的動(dòng)植物的100個(gè)物種，共371條轉(zhuǎn)鐵蛋白基因進(jìn)行研究。研究表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)基因在動(dòng)物中廣泛分布，但是其基因數(shù)目和類型在不同的

5、動(dòng)物分類族群中有很大的區(qū)別。一般說來，哺乳動(dòng)物中基因組中有大量的轉(zhuǎn)鐵蛋白基因，而吸蟲類動(dòng)物僅少數(shù)的基因存在。其中，黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白（Melanotransferrin）和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Serotransferrin)廣泛分布于脊椎動(dòng)物，而類黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白（Melanotransferrin-like）和Ⅰ型類轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin-like1)在所選非脊椎動(dòng)物各物種中都有分布。本研究從少數(shù)幾個(gè)植物物種的基因組中首次推斷出轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)

6、基因的存在，其分布在被子植物和蕨類植物中。通過比較其中6個(gè)重要家族成員的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)7個(gè)高度保守的特征模體。進(jìn)化樹的構(gòu)建表明，基因復(fù)制、基因丟失以及基因漂移是推動(dòng)轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員多樣性的重要原因，同時(shí)，本試驗(yàn)提出各家族成員可能經(jīng)歷的進(jìn)化事件。綜上所述，本研究的發(fā)現(xiàn)有助于更全面深入地了解轉(zhuǎn)鐵蛋白家族基因的分布、特征模體和殘基，及其家族的進(jìn)化進(jìn)程。
　　3.乳鐵蛋白在食品級(jí)乳酸菌中的表面表達(dá)
　　以乳鐵蛋白N端活性肽為目的基因，

7、自溶素基因（acmA）作為細(xì)胞表面錨定結(jié)構(gòu)域，抗菌肽基因nisⅠ作為食品級(jí)篩選標(biāo)記基因，利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了pMG36-acmA-bLfcin-nisⅠ穿梭表達(dá)載體，并將其電轉(zhuǎn)化進(jìn)入食品級(jí)乳酸乳球菌MG1614中，成功獲得陽性轉(zhuǎn)化子，通過測(cè)序結(jié)果證明成功構(gòu)建了含有表面錨定基因和食品級(jí)抗性基因的能高效表達(dá)乳鐵蛋白N端多肽的食品級(jí)乳酸乳桿菌MG1614(pMG36-acmA-bLfcin-nisⅠ)。
　　4.Lactobac

8、illus casei12AE1在合成水解液中發(fā)酵時(shí)對(duì)抑制物耐受性研究
　　乳酸菌作為食品級(jí)菌株是酒精發(fā)酵生產(chǎn)中常見的易染菌，說明它耐受高濃度酒精、耐受水解液中pH的變化。基于L.casei12AE1的酒精耐受性（＞10％的酒精濃度），碳源利用性和相對(duì)較高的電轉(zhuǎn)化效率，本研究主要對(duì)水解液中存在的抑制物因子對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響進(jìn)行了探討。研究表明，乳酸乳球工程菌L.casei12AE1具有更好的木質(zhì)纖維素抑制物耐受性;木質(zhì)毒素作為