布拉氏酵母菌表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、布拉氏酵母菌是一種從印尼荔枝等水果中分離到的非致病性益生酵母菌，具有抗菌、抗毒、止瀉、維持宿主胃腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體非特異性免疫力等益生性。目前，布拉氏酵母菌的研究主要集中在臨床應(yīng)用方面，而針對(duì)其作用機(jī)制，特別是在分子水平上的作用機(jī)制，以及遺傳改造等卻少有研究和報(bào)導(dǎo)。
　　自Smith提出表面展示技術(shù)以來(lái)，表面展示技術(shù)得到了快速發(fā)展。對(duì)于真核生物蛋白來(lái)說(shuō)，酵母表面展示系統(tǒng)無(wú)疑是比較理想的表面展示系統(tǒng)。利用益生菌表面展示系統(tǒng)研究

2、活載體疫苗是醫(yī)學(xué)以及獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的應(yīng)用之一，人們已經(jīng)利用釀酒酵母和乳酸桿菌作為平臺(tái)研究活載體疫苗，而布拉氏酵母菌作為最有價(jià)值的益生菌之一，其表面展示系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)導(dǎo)。
　　本研究利用a-凝集素成功地構(gòu)建了兩種布拉氏酵母菌表面展示系統(tǒng):瞬時(shí)表達(dá)表面展示系統(tǒng)和穩(wěn)定表達(dá)表面展示系統(tǒng)。這是第一次將表面展示技術(shù)用于布拉氏酵母菌中，拓寬了布拉氏酵母菌的應(yīng)用領(lǐng)域。
　　本研究主要做了以下三方面的工作:
　?。ㄒ唬┧矔r(shí)表達(dá)表

3、面展示系統(tǒng):
　　1.瞬時(shí)表達(dá)表面展示質(zhì)粒的構(gòu)建:將AGA1基因(SbAGA1)以及AGA2表達(dá)盒克隆到基礎(chǔ)質(zhì)粒pSP-G1上，使SbAGA1生持續(xù)表達(dá)啟動(dòng)子pTEF1的控制之下，AGA2表達(dá)盒在持續(xù)表達(dá)啟動(dòng)子pPGK1的控制之下，構(gòu)建了瞬時(shí)表達(dá)表面展示質(zhì)粒pSDSb;將SbAGA1基因和AGA2表達(dá)盒克隆到基礎(chǔ)質(zhì)粒pSP-G2上，使SbAGA1在持續(xù)表達(dá)啟動(dòng)子pPGK1的控制之下，AGA2表達(dá)盒在持續(xù)表達(dá)啟動(dòng)子pTEF1的控制之

4、下，構(gòu)建了瞬時(shí)表達(dá)表面展示質(zhì)粒pSDSb2。
　　2.利用EGFP蛋白作為報(bào)告蛋白，鑒定瞬時(shí)表達(dá)表面展示系統(tǒng)的可用性:將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因克隆到pSDSb、pSDSb2質(zhì)粒上的AGA2基因表達(dá)盒內(nèi)，構(gòu)建EGFP表面展示質(zhì)粒。熒光分析和Western blot結(jié)果表明，EGFP蛋白能夠展示在布拉氏酵母菌細(xì)胞表面。
　　3.不同來(lái)源的Aga1p對(duì)EGFP蛋白展示效率的比較:分析SbAGA1基因和ScAGA1基因的

5、同源性以及SbAGA2基因和ScAGA2的同源性，利用熒光分析和流式細(xì)胞術(shù)比較pSDSb和pSDSc兩種表面展示質(zhì)粒對(duì)外源蛋白的展示效率。熒光分析結(jié)果和流式結(jié)果表明，pSDSb和pSDSc兩種表面展示質(zhì)粒對(duì)外源蛋白的展示效率差異不顯著(P=0.974)。
　?。ǘ┓€(wěn)定表達(dá)表面展示系統(tǒng):
　　1.穩(wěn)定表達(dá)表面展示質(zhì)粒的構(gòu)建:破壞瞬時(shí)表達(dá)表面展示質(zhì)粒上的2-micron origin元件，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)表面展示質(zhì)粒pLSDSb和

6、pLSDSb2。
　　2.利用EGFP蛋白作為報(bào)告蛋白，鑒定穩(wěn)定表達(dá)表面展示系統(tǒng)的可用性:將EGFP基因克隆到pLSDSb、pLSDSb2質(zhì)粒上的AGA2基因表達(dá)盒內(nèi)，構(gòu)建EGFP表面展示質(zhì)粒。熒光分析和Western blot結(jié)果表明，EGFP蛋白能夠展示在布拉氏酵母菌細(xì)胞表面。
　　（三）布拉氏酵母菌表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用研究
　　1.瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)表面展示系統(tǒng)對(duì)EGFP蛋白展示效率的比較:利用熒光、流式分析比較兩

7、種表面展示系統(tǒng)對(duì)EGFP的展示效率，熒光結(jié)果表明:在培養(yǎng)24h時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)表面展示系統(tǒng)可將EGFP展示在酵母細(xì)胞表面，培養(yǎng)120h后，熒光逐漸消失;與瞬時(shí)表達(dá)表面展示系統(tǒng)不同，在培養(yǎng)36h時(shí)，穩(wěn)定表達(dá)表面展示系統(tǒng)可將EGFP展示在酵母細(xì)胞表面，只要培養(yǎng)酵母細(xì)胞，外源蛋白可一直表達(dá)。流式結(jié)果表明:pSDSb-GFP的展示效率為87.89％，pLSDSb-GFP的展示效率為92.34％，pLSDSb2-GFP的展示效率為92.45％，說(shuō)明穩(wěn)