13357.乳酸菌融合表達(dá)載體的構(gòu)建及α淀粉酶基因的克隆與表達(dá)

1、分類(lèi)號(hào)：Q2晝密級(jí)：公玨單位代碼：lQQ晝魚(yú)學(xué)號(hào)：2Q!Q151乳酸菌融合表達(dá)載體的構(gòu)建及Q一淀粉酶基因的克隆與表達(dá)ConstructionoftheFusionExpressionVectorandtheCloneandExpressionofa—amylaseGeneforLacticAcidBacteria學(xué)位申請(qǐng)人：寇田田指導(dǎo)教師：田洪濤教授學(xué)科專(zhuān)業(yè)：發(fā)酵工程學(xué)位類(lèi)別：工學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一三年五月二十九

2、日摘要乳酸菌作為一種重要的工業(yè)微生物，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用NJ“畜牧、食品、醫(yī)藥等眾多行業(yè)，是目前最常用的益生菌。隨著對(duì)乳酸菌生理生化等研究的深入，人們更加迫切的想要揭示乳酸菌在人和動(dòng)物體內(nèi)定植、分布、存活及其益生特性的活性機(jī)理，這就需要借助分子生物學(xué)的手段來(lái)構(gòu)建具有指示作用的工程菌株。紅色熒光蛋f芻dsred2基因是一種堪稱(chēng)完美的熒光標(biāo)記分子，其成熟后可以不用熒光激發(fā)，用肉眼在日光下就可以檢測(cè)到鮮艷的紅色。用紅色熒光蛋A基因標(biāo)記乳酸菌及其蛋

3、白然后進(jìn)行跟蹤觀察，可以幫助研究乳酸菌的一些生理機(jī)制及功能基因的作用。本研究在大腸桿菌乳酸菌穿梭載體pMG36e的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了以紅色熒光蛋A基因?yàn)闃?biāo)記的乳酸菌融合表達(dá)系統(tǒng)pMG36edsred2，并以Q淀粉酶(amy)為報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)了融合基因dsred2amy在乳酸菌內(nèi)的融合表達(dá)。研究得到以下結(jié)果：根據(jù)Genebank上公布的dsred2基因序列，設(shè)計(jì)合成引物，并在引物上、下游分別添加X(jué)baI與HindlII兩酶切位點(diǎn)，然后以質(zhì)粒pP

4、IC9kdsred2為模板擴(kuò)增得到dsred2基因的全部編碼區(qū)序列，并將其連接到克隆型載體pMDl9一T上。用XbaI、HindIII同時(shí)雙酶切載體pMG36e與pMDl9T，回收線性pMG36e和小片段dsred2，然后將二者用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組載體pMG36edsred2。以地衣芽孢桿菌基因組為模板，根據(jù)Genebank上公布的amy基因序列設(shè)計(jì)引物，在引物上下游分別添加SacI與XbaI兩酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增只帶有起始

5、密碼子不帶有終止密碼子的a一淀粉酶基因，將其連接到克隆型載體pEASYT1。然后用SacI、XbaI兩限制性內(nèi)切酶同時(shí)雙酶切載體pMG36edsred2與pEASYT1amy，回收amy片段與線性pMG36e—dsred2，之后用T4連接酶將二者連接使amy基因與dsred2融合，得到dsred2與amy基因融合的表達(dá)載體pMG36edsred2amy。最后將該載體電轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌，檢測(cè)重組蛋白活性。研究發(fā)現(xiàn)紅色熒光蛋白基因dsred2

6、與融合基因dsred2一amy均能夠在大腸桿菌及乳酸菌中表達(dá)。紅色熒光蛋白基因在pMDl9T上有紅色熒光，其強(qiáng)度比pMG36e載體上的鮮艷；融合蛋A在大腸桿菌和乳酸菌分別具有dsred2、amy基因活性，表達(dá)強(qiáng)度在融合前后沒(méi)有明顯差別。SDSPAGE凝膠電泳分析證實(shí)dsred2基因與amy基因融合成功，dsred2蛋A分子量為248kDa，融合蛋白dsred2amy的分子量為815kDa。本研究成功構(gòu)建了乳酸菌融合表達(dá)載體pMG36ed