鴨坦布蘇病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒引起的一種新發(fā)病毒病，病鴨主要表現(xiàn)為高熱、食欲下降、產(chǎn)蛋下降，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失。本研究利用前期分離鑒定得到的一株強(qiáng)毒株FX2010株，建立了該毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為研究該病毒分子致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　為建立FX2010株的反向遺傳操作系統(tǒng)，首先提取病毒的RNA，利用RT-PCR方法，分片段擴(kuò)增了病毒的全基因組，相鄰片段的末端序列相互重疊。病毒基因組4020位之前的片段

2、通過融合PCR的方式擴(kuò)增得到，作為全長(zhǎng)基因的前半段;根據(jù)病毒基因組中單一酶切位點(diǎn)的位置，將病毒基因組的3656位至10991位的序列克隆至pSIMPLE18平端載體上，從而得到覆蓋鴨坦布蘇病毒后半段基因組的質(zhì)粒3-N-pSIMPLE。在5'端引入T7啟動(dòng)子，用ApaL(Ⅰ)酶切3-N-pSIMPLE得到后半段，利用融合PCR的方法得到該病毒的全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物。然后利用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備具有感染性的病毒體外轉(zhuǎn)錄本，純化后轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞并

3、注意觀察細(xì)胞變化，與對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染病毒RNA的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48h后開始出現(xiàn)病變，72h出現(xiàn)明顯病變。經(jīng)過RT-PCR，間接免疫熒光(IFA)等多種方法鑒定，證明病毒拯救成功。經(jīng)過序列比對(duì)，拯救病毒的序列與鴨坦布蘇病毒FX2010株的序列完全一致。
　　為了探索鴨坦布蘇病毒致病的分子機(jī)制，利用構(gòu)建的反向遺傳操作系統(tǒng)，利用PCR方法將強(qiáng)毒株FX2010的E基因用弱毒株FX2010-180P的E基因替換，擴(kuò)增獲得強(qiáng)毒背景下含弱毒E基因