貓泛白細胞減少癥病毒反向遺傳學操作系統(tǒng)的建立.pdf

1、貓泛白細胞減少癥病毒（Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV，F(xiàn)LPV），又稱貓細小病毒。主要易感動物是貓，故而又稱為貓瘟熱病，也可感染貓以外的多種貓科動物。由于細小病毒顆粒體積極小，最初并沒有學者報道。隨著電鏡及病毒分離技術廣泛使用，科研者在傳代細胞和腫瘤組織陸續(xù)分離到細小病毒。法國人Verge首次發(fā)現(xiàn)，1939年正式命名，1985年首次在我國自然感染病例中分離到一株貓細小病毒，從而證實貓細小病毒在我國流行。19

2、86年國內(nèi)文獻首次報道云豹、非洲幼獅、華南虎均感染了FPV。由此證明：虎、豹、獅等多種珍稀野生動物已經(jīng)嚴重受到貓泛白細胞減少癥病毒的威脅。我國某實驗動物基地2008年從猴傳染性腹瀉病料中分離到一株貓細小病毒的變異株（BJ-22株），其VP2氨基酸序列與FPV的同源性高達98.75％，與CPV的同源性為98.15%?？梢?，F(xiàn)PV宿主感染譜正在不斷擴大，已由最初的貓科動物擴展至非人靈長類，對社會公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大威脅。
　　本文首先

3、對FPV HH-1/86株細小病毒理化性質(zhì)進行鑒定，并對其全基因組進行測序。在此基礎上構(gòu)建該株細小病毒感染性克隆pFPV，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導入F81細胞，成功拯救獲得帶有遺傳標記的重組病毒 rFPV。為揭示貓細小病毒高頻率跨物種傳播特征和分子機制提供反向遺傳學操作平臺；為貓細小病毒跨物種傳播預警和有效防治提供科學依據(jù)。
　　該株病毒電鏡下可見直徑20nm左右的立體對稱細小病毒粒子。經(jīng)實驗證實：該病毒在連續(xù)50℃加熱1h、pH3

4、.0作用2h和乙醚作用2h，病毒TCID50升高不到一個對數(shù)，表明病毒對熱、酸、乙醚具有一定的耐受性，pH在5.8～6.80.015M PBS均能凝集1%豬紅細胞，其中pH6.5血凝活性最佳。該病毒全基因組長5123nt，C+G的含量為36.35%。3’末端反向重復序列（Inverted Terminal Repeats，ITR）形成Y型結(jié)構(gòu)，長126nt；5’末端ITR形成U型結(jié)構(gòu)，長198nt。
　　本實驗利用overlap

5、PCR方法，以病毒基因組片段M1、M2、M3為模板，克隆基因組中間大片段M1+M2+M3，經(jīng)凝膠電泳鑒定正確。通過Infusion克隆技術將中間片段M1+M2+M3插入含3’和5’端質(zhì)粒pE中。體外定點突變：將2981nt由A→G，產(chǎn)生一個新酶切位點Xho I，構(gòu)建FPV全基因組感染性克隆pFPV。經(jīng)酶切和序列測定證明pFPV正確，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，以Lip3000與質(zhì)粒pFPV按7.5μL：3.5μg比例轉(zhuǎn)染F81細胞。轉(zhuǎn)染后72h，

6、細胞出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)、脫落等細小病毒細胞病變，將rFPV0三凍三融后按5%同步接毒，第2代后rFPV接毒量降至1%同步接毒，連續(xù)傳代至15代，用于病毒鑒定。通過CPE鑒定、免疫熒光、生長曲線、血凝試驗、western blot試驗，結(jié)果證明，rFPV與親代毒（FPV HH-1/86）病毒學及生物學特性沒有明顯差異。
　　本研究為探究貓細小病毒跨物種傳播關鍵氨基酸位點、揭示貓細小病毒高頻率跨物種傳播分子機理，從而有效防治貓細小病毒跨物種