鴨坦布蘇病毒的分離、鑒定.pdf

1、本研究從西南地區(qū)的某鴨養(yǎng)殖場無菌采集有疑似坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)癥狀的病鴨肝臟組織，開展了以下研究:疑似病毒的分離、鑒定;TMUV對鴨胚成纖維細胞及雛鴨的致病性試驗;TMUV的全基因組序列的擴增、遺傳進化分析。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.疑似病毒的分離、鑒定:采集的病料組織經(jīng)剪碎、研磨、離心、過濾除菌后，接種于9日齡健康鴨胚并收集尿囊液按照常規(guī)病毒分離方法進行盲傳。該病毒在鴨胚傳代過程中，自盲傳至

2、3代以后，病毒液可導致鴨胚于3-4d內(nèi)死亡，并致使鴨胚胚體水腫、出血，胚肝水腫、壞死。經(jīng)鑒定，病毒的核酸類型為RNA，病毒為有囊膜病毒，不耐酸，對氯仿、乙醚等有機溶劑敏感，符合黃病毒成員的基本生物學特征。對收集的尿囊液經(jīng)PCR或RT-PCR檢測，其他幾種常見鴨源病原如鴨瘟病毒(Duckplague virus，DPV)、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)、鴨乙型肝炎病毒(DuckHepatitis BVirus，DH

3、BV)、鴨源禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)檢測為陰性。根據(jù)TMUV-WR株NS3-NS4片段保守序列設(shè)計的特異性引物通過RT-PCR方法擴增出疑似目的條帶(1250 bp)，經(jīng)測序、比對后發(fā)現(xiàn)，與已公布的黃病毒科黃病毒屬恩他耶病毒IPDIA分離株核苷酸（GenBank NO: NC_018705）相似性為72.3％，與國內(nèi)已公布的TMUV分離株相比，同GX2013H株(GenBank NO: KJ700

4、462)相似性最高，為99.4％，同lq-1株(GenBank NO: KF557893)相似性最低，為96.8％。綜上所述，我們初步分離得到一株源于西南地區(qū)的鴨源坦布蘇病毒，將其命名為CQW1。
　　2.TMUV-CQW1株對鴨胚成纖維細胞及雛鴨的致病性試驗:以鴨胚傳代至第五代病毒液為母液，接種于單層致密的鴨胚成纖維細胞孵育，培養(yǎng)，觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒后24 h細胞開始出現(xiàn)圓縮，48 h圓縮的細胞增多，72 h細胞內(nèi)空泡串聯(lián)形成

5、較大空泡，細胞脫落死亡。表明CQW1可在鴨胚成纖維細胞上進行培養(yǎng)增殖，并可以引起明顯的細胞病變。經(jīng)測定，獲取的病毒液滴度為105.5 TCID50/0.05 mL。選取20只7日齡櫻桃谷雛鴨進行了動物回歸試驗，其中10只通過頸靜脈注射0.2 mL(含102.75 ELD50)病毒液作為攻毒組，10只通過注射等量PBS溶液分籠飼養(yǎng)作為陰性對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雛鴨攻毒后出現(xiàn)明顯的食欲下降、不愿走動，精神萎靡、共濟失調(diào)，死亡時呈角弓反張等神經(jīng)癥

6、狀。攻毒組共10只發(fā)病，發(fā)病率為100％，6只于攻毒后自然死亡，死亡率為60％;對照組無明顯臨床癥狀。動物回歸試驗結(jié)果表明，CQW1株能夠引起雛鴨死亡，死亡率可達60％。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能夠從病鴨的血液、肝臟、大腦組織中檢測到TMUV。病理學觀察結(jié)果表明，CQW1株可導致腦膜血管充血、脫落，同時引起大腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生，大量神經(jīng)膠質(zhì)細胞趨向壞死的神經(jīng)元細胞，形成明顯的“噬神經(jīng)元現(xiàn)象”。另外可導致病鴨肝臟出血、淤血，大量肝細胞變

7、性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，同時存在有較多新生肝細胞。
　　3.TMUV-CQW1株的全基因組序列的擴增及遺傳進化分析:通過設(shè)計相互覆蓋TMUV cDNA全長的引物，分段擴增、測序、拼接獲得了CQW1株全長基因組序列(GenBank NO.KM233707)。全基因組序列分析結(jié)果表明，CQW1株全長10992 nt，含有一個開放閱讀框(ORF)，編碼一個長為2625 aa的多聚蛋白，預(yù)測的多聚蛋白切割位點與其他TMUV成員一致，共編

8、碼10個功能蛋白。黃病毒代表成員以及坦布蘇病毒分離株的進化樹分析表明，CQW1株屬于黃病毒屬恩他耶家族成員，CQW1與其他TMUV成員在全基因組核苷酸和氨基酸相似性分別為96.8％-99.1％，98.4％-99.6％，與廣西株GX2013H親緣關(guān)系最近，兩者夠成了一個獨立的進化分枝。與國內(nèi)其他分離株相比，CQW1同其他分離株的平均進化距離(0.0299)高于其他毒株之間的平均進化距離(0.0163)，表明CQW1株同其他分離株相比，有一