羊種布魯氏菌M5-90疫苗株bp26基因突變株的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、布魯氏菌是一種革蘭氏陰性、兼性胞內(nèi)寄生菌，由其引發(fā)的布魯氏菌病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛存在并傳播的、以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人畜共患傳染病。該病對人、畜危害極大，近年呈現(xiàn)出回升的勢頭。“檢、殺、免”是當(dāng)前防控、消滅動物布魯氏菌病的主要手段。我國自主研制的羊型M5-90疫苗因其免疫效果好，可有效預(yù)防綿羊和山羊布魯氏菌病。但是該疫苗毒力較強(qiáng)，可造成部分懷孕母畜流產(chǎn)，同時無法區(qū)分疫苗免疫和自然感染，從而限制了其在實際中的應(yīng)用。因此研制一種毒力較弱、

2、具有較好免疫原性，并能進(jìn)行鑒別診斷的新型疫苗勢在必行。
　　 本研究以羊種布魯氏菌M5-90疫苗株為模板，克隆編碼bp26部分功能區(qū)域序列EP261，EP262的上下游側(cè)翼序列，采用融合PCR方法將上下游臂融合，連接T載體測序后，雙酶切并與自殺載體pGEM-7Zf+連接；將克隆的枯草芽孢桿菌SacB基因連接至pGEM-7Zf-bp261、pGEM-7Zf-bp262，然后將構(gòu)建好的同源重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至布魯氏菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過同

3、源重組的方法獲得基因突變株M5-90rbp261和M5-90rbp262；對獲得的基因突變株進(jìn)行PCR鑒定和穩(wěn)定性檢測；用布魯氏菌M5-90疫苗株、M5-90 rbp261和M5-90rbp262突變株分別免疫SPF級BALB/c小鼠，通過虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗初步驗證小鼠體內(nèi)的抗體水平，采用間接ELISA的方法測定小鼠體內(nèi)總IgG水平以及細(xì)胞因子IFN-γ的水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞的含量；采用脾臟指數(shù)法

4、確定基因突變株與親本株之間的毒力差異；攻毒試驗檢測各菌株的保護(hù)力；PCR擴(kuò)增bp26基因中55-152段（BP261）及22-185段（BP262）氨基酸區(qū)域，將測序正確的基因序列克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-32a上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DE3（BL21）中誘導(dǎo)表達(dá)，以純化的BP261，BP262蛋白作為抗原，與突變株M5-90rbp261和M5-90rbp262免疫小鼠的血清進(jìn)行Western Blot分析。
　　 本研究主要獲

5、得如下結(jié)果：
　　 1.成功獲得基因突變株M5-90rbp261和M5-90rbp262，在15代內(nèi)未發(fā)生回復(fù)突變，革蘭氏染色顯示突變株生理特征未發(fā)生改變，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 2.免疫原性研究結(jié)果顯示兩基因突變株均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生與親本株接近甚至略高于親本株的抗體水平，同時可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　 3.毒力試驗結(jié)果表明兩基因突變株毒力均減弱，M5-90rbp262的毒力下降顯著。

6、　　 4.攻毒試驗結(jié)果顯示突變株M5-90rbp261、M5-90rbp262在保護(hù)機(jī)體抵御16M感染方面的能力與親本株M5-90相當(dāng)。
　　 5.純化得到可以高效表達(dá)的BP261和BP262蛋白。
　　 6. Western Blot分析顯示表達(dá)的BP261和BP262在與免疫小鼠血清進(jìn)行反應(yīng)時，與M5-90免疫的陽性血清出現(xiàn)了條帶，而與突變株免疫小鼠血清均未出現(xiàn)條帶，因此可作為突變株配套使用的檢測蛋白，用于布魯氏菌