牛種布魯氏菌2308株wbkA、pmm基因缺失株的構(gòu)建及免疫效果的初步研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病)是由革蘭氏陰性菌布魯氏菌引起的一類人獸共患的慢性傳染病,目前在我國以及世界上大多數(shù)國家有比較廣泛的流行。該病原菌可感染多種家畜及人,還可感染野生動物,近來還發(fā)現(xiàn)該病菌還可感染海洋動物。人類感染布魯氏菌用抗生素治療需要持續(xù)幾個月但不是完全有效,對人類而言沒有有效的疫苗,有幾個許可的活疫苗可以在牲畜上使用,而這些動物疫苗的效果取決于宿主的種類、免疫劑量、免疫途徑。目前世界各國對布病的防控都主要采

2、用的是疫苗接種,然而又因現(xiàn)用疫苗都普遍存在毒力較強,可引起懷孕母畜的流產(chǎn),甚至還可感染人等缺陷,同時使用了疫苗后難以區(qū)分自然感染和疫苗免疫,從而限制了疫苗的實際應(yīng)用。因此,本研究擬通過缺失牛種布魯氏菌2308的wbkA,pmm基因構(gòu)建相應(yīng)的缺失株,初步評價其毒力和免疫保護效果。同時表達了WBKA,PMM兩個蛋白,開發(fā)出一種能有效區(qū)分自然感染和疫苗免疫的布魯氏菌弱毒基因缺失株,旨在篩選具有潛在應(yīng)用價值的疫苗候選株。本文所做的主要工作及成果

3、如下:
　　1.布魯氏菌2308株wbkA和pmm基因缺失株的構(gòu)建及鑒定:以牛種布魯氏菌2308為模板高保真擴增wbkA和pmm基因上下游同源臂,以枯草芽孢桿菌為模板高保真擴增SacB基因,將得到的上下臂SacB與分別連接到pGEM-7zf+,構(gòu)建pGEM-7zf-ΔwbkA-SacB(pwS)和pGEM-7zf-Δpmm-SacB(ppS)。自殺載體pGEM-7Zf+上,分別構(gòu)建成pGEM-7Zf+-ΔwbkA和pGEM-7zf

4、+-Δpmm,制備牛種布魯氏菌2308感受態(tài),電轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pwS和ppS,通過氨芐、蔗糖的兩次篩選得獲得ΔwbkA和Δpmm基因缺失株,進行遺傳穩(wěn)定性檢測。
　　2.ΔwbkA和Δpmm基因缺失株的毒力及免疫效果的初步評價:在小鼠巨噬細胞RAW264.7水平初步驗證ΔwbkA和Δpmm的毒力;用缺失株免疫6周齡昆明白小鼠,通過CFU計數(shù)初步評價缺失株的毒力;通過常規(guī)血清學(xué)試驗初步驗證小鼠體內(nèi)的抗體水平,采用間接ELISA方法檢測

5、小鼠體內(nèi)總IgG水平以及細胞因子IFN-γ的水平;對用缺失株免疫30d后的小鼠進行攻毒試驗評價其保護效果。
　　3.構(gòu)建原核表達載體pET-wbkA和pET-pmm及鑒別診斷:用PCR方法分別擴增wbkA和pmm基因,將測序正確的基因序列分別克隆到大腸桿菌表達載體pET-32a上,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3(BL21)中誘導(dǎo)表達并純化WBKA和PMM蛋白,再以純化的WBKA和PMM蛋白作為抗原,與缺失株ΔwbkA和Δpmm免疫的小鼠

6、血清進行Western blot分析,鑒定血清中是否存在抗WBKA和PMM的抗體。
　　本研究結(jié)果表明ΔwbkA和Δpmm缺失株具有一定的遺傳穩(wěn)定性,ΔwbkA和Δpmm缺失株的毒力較親本株2308相比有一定程度的下降,且毒力與疫苗株S19差異不大。免疫原性試驗結(jié)果顯示同時ΔwbkA和Δpmm缺失株均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一定的抗體。攻毒試驗結(jié)果表明缺失株能保護小鼠免受2308強毒株的感染,保護力與疫苗株S19相比略低。WB結(jié)果顯示Δwb