布魯氏菌S2308株ery啟動(dòng)子缺失株的構(gòu)建及wboA抗原表位的分析驗(yàn)證.pdf

1、布魯氏菌?。˙rucellaabortus）是革蘭氏陰性菌，專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生，可感染人類(lèi)及多種動(dòng)物引起發(fā)熱、流產(chǎn)、不育、慢性關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損傷等，導(dǎo)致世界范圍嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前尚沒(méi)有有效的防治手段，疫苗接種是預(yù)防該病的主要手段。蘚醇激酶（ery）是流產(chǎn)布魯氏菌的毒力基因，本研究通過(guò)對(duì)牛種布魯氏菌S2308株ery啟動(dòng)子基因敲除構(gòu)建ery啟動(dòng)子基因缺失株，觀察是否可降低毒力；評(píng)價(jià)該缺失株作為疫苗候選株的價(jià)值；同時(shí)表達(dá)了eryA

2、蛋白，為區(qū)別布魯氏菌自然感染與疫苗免疫提供包被抗原；另外，S19疫苗株在防治牛布病方面取得明顯的效果，但是牛種布魯氏菌疫苗S19免疫懷孕的動(dòng)物可能導(dǎo)致其流產(chǎn)，且常規(guī)的血清學(xué)檢測(cè)與診斷方法不能將其與自然感染相區(qū)分，這對(duì)我國(guó)布病的防治與凈化是不利的。前期研究表明布魯氏菌WboA基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，是合成LPSO-側(cè)鏈多糖的必需基因之一，M5-90wboA敲除株可以區(qū)別自然感染和疫苗感染。但M5-90敲除WboA株保護(hù)率比親本株降低10％本研

3、究擬對(duì)S19wboA基因的抗原表位分析并構(gòu)建自殺載體為S19疫苗株的進(jìn)一步改造提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究以滅活的流產(chǎn)布魯氏菌S2308株為模板，擴(kuò)增赤蘚醇激酶（ery）啟動(dòng)子基因的上下游同源臂序列；以枯草芽孢桿菌為模板，擴(kuò)增SacB基因序列。將擴(kuò)增好的序列分別連接到自殺載體pGEM-7Zf+上，成功構(gòu)建了pGEM-7Zf-ery-sacB自殺載體，將構(gòu)建好的載體命名為：pes，然后將pes電轉(zhuǎn)至流產(chǎn)布魯氏菌S2308株感受態(tài)細(xì)胞，

4、通過(guò)同源重組的方法成功構(gòu)建S2308ery啟動(dòng)子基因缺失株，命名為：S2308Δery，對(duì)S2308Δery株進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，傳至15代遺傳穩(wěn)定。用S2308Δery株侵染胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞，細(xì)胞脫落結(jié)果顯示：S2308Δery株的毒力較親本S2308株明顯下降，其毒力與S19株相當(dāng)。該缺失株通過(guò)缺失S2308ery啟動(dòng)子基因，將ery整個(gè)開(kāi)放閱讀框失活，為S2308株向疫苗株的改造奠定基礎(chǔ)。
　　用DNAman和GENGrun

5、ner對(duì)wboA基因進(jìn)行了抗原表位分析，選取抗原表位1（w-1）、抗原表位2(w-2)、抗原表位1和2（w-1-2）及wboA作為本試驗(yàn)的研究對(duì)象。以滅活的S19為模板，成功擴(kuò)增了wboA基因及其3個(gè)抗原表位基因；以滅活的流產(chǎn)布魯氏菌S2308株為模板，成功擴(kuò)增了eryA基因。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了wboA基因及其抗原表位基因和eryA基因的原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳顯示：wboA基因及其抗原表位基因和eryA基

6、因蛋白在原核表達(dá)載體中成功表達(dá)；westernblot分析結(jié)果顯示：wboA基因及其抗原表位基因和eryA基因具有良好的免疫反應(yīng)性。對(duì)wboA及其抗原表位蛋白和S2308株eryA蛋白進(jìn)行了純化。wboA及其抗原表位蛋白為后續(xù)的S19疫苗改造以及相應(yīng)相應(yīng)缺失株的血清學(xué)的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。eryA蛋白為S2308Δery株的血清學(xué)鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。
　　對(duì)wboA及其抗原表位基因的上下游同源臂基因進(jìn)行了擴(kuò)增，擴(kuò)增了負(fù)篩選標(biāo)記Sa