結(jié)核分枝桿菌無(wú)毒株H37Ra啟動(dòng)子突變基因的比較分析.pdf

1、目的：通過(guò)分析結(jié)核分枝桿菌無(wú)毒株H37Ra的全基因組序列,并與H37Rv基因組序列比較,發(fā)現(xiàn)一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了突變,我們利用分枝桿菌啟動(dòng)子探針載體pMC210,分別構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌H37Ra和H37Rv的六個(gè)重要基因(sec、pabB、phoH2、sigC、nrdH、lpdA)的啟動(dòng)子探針重組載體。利用報(bào)告基因lacZ檢測(cè)突變前后啟動(dòng)子的活性變化。同時(shí),確認(rèn)啟動(dòng)子突變與其基因轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系,探索結(jié)核分枝桿菌H37Ra毒力喪失的

2、內(nèi)在因?yàn)椤?br>　　 方法：利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)這六對(duì)基因(sec、pabB、phoH2、sigC、nrdH、lpdA)的啟動(dòng)子區(qū)域,采用PCR技術(shù)克隆這六對(duì)基因的啟動(dòng)子,雙酶切后與分枝桿菌啟動(dòng)子探針載體pMC210對(duì)應(yīng)的雙酶切片段相連,DNA測(cè)序證實(shí)連接片段正確后,用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌mc2155中。通過(guò)體外測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性來(lái)評(píng)估啟動(dòng)子的強(qiáng)度和Quantitative Real-Time RT-PCR的

3、方法檢測(cè)報(bào)告基因lacZ的轉(zhuǎn)錄水平差異,檢測(cè)啟動(dòng)子的突變對(duì)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　 結(jié)果：通過(guò)PCR和構(gòu)建克隆測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)基因sec、phoH2、sigC、nrdH的啟動(dòng)子與GenBank上提交的序列存在差異,結(jié)核分枝桿菌無(wú)毒株H37Ra和有毒株H37Rv相比較,基因sec、phoH2、sigC、nrdH預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子并沒(méi)有突變。只有基因pabB和lpdA存在啟動(dòng)子突變。H37Rv和H37Ra的pabB基因的啟動(dòng)子探針重組載

4、體轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌后,體外測(cè)定的β-半乳糖苷酶的活性較弱,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而Quantitative Real Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示H37Ra pabB啟動(dòng)子調(diào)節(jié)報(bào)告基因lacZ轉(zhuǎn)錄的活性是H37Rv pabB啟動(dòng)子的6倍(p<0.05),H37Rv和H37Ra lpdA啟動(dòng)子探針重組載體體外測(cè)得的β-半乳糖苷酶的活性和Real time PCR結(jié)果均顯示H37Rv lpdA啟動(dòng)子調(diào)節(jié)報(bào)告基因lacZ表達(dá)的活性比H37Ra lpd