中國結核分枝桿菌群體基因組的分析.pdf

1、結核分枝桿菌作為結核病的病原菌，自上世紀五十年代以來，不斷發(fā)現有效的抗結核菌藥物，使古老的結核病流行得到了一定的控制，但是由于不少國家對結核病的忽視，艾滋病的并發(fā)感染和抗生素的濫用等，結核病死灰復燃。在中國、印度等地出現了越來越多的耐藥結核分枝桿菌，作為中國盛行的lineage2型別也被認為具有更強耐藥性、更強毒力的現代型結核菌，這也使得對結核流行病學的、耐藥相關的、lineage2型別相關的研究成為關注熱點。本實驗室通過在中國地區(qū)廣泛

2、的收集臨床耐藥結核菌株等，運用高通量二代全基因組測序，對161株結核分枝桿菌進行生物信息分析，從基因組水平挖掘結核分枝桿菌的進化過程、型別特征和耐藥相關區(qū)域等。本研究的主要結果如下：
　　1.通過與NCBI數據庫中22株已知分型的結核分枝桿菌復合群構建系統發(fā)育樹，確定了收集的161株中國臨床菌株分別屬于lineage2(122株)、lineage3(2株)和lineage4(37株)。在群體結構方面重點對主要流行的lineage2

3、和lineage4展開分析，從分類比較菌株中突變位點數量發(fā)現，結核菌株型別間的差異要比耐藥與敏感菌株間的差異要更具有統計學意義，即不同型別間存在明顯的突變位點數量的差異。
　　2.基于推測的祖先序列，統計屬于lineage2型別相關的位點為295個，lineage4型別相關的突變位點為167個。從G:C>T:A的顛換與G:C>A: T轉換的比值中得知，屬于lineage2型別相關的SNPs為氧化損傷導致的突變比例較lineage4

4、要大，而氧化損傷又被報道同結核菌的耐藥性相關，因此lineage2基因組易發(fā)生氧化損傷的突變也為lineage2易突變和易耐藥的原因提供條可能線索。另外，我們發(fā)現，相對于lineage4型別相關nsSNPs，lineage2型別相關的nsSNPs存在一定數量的影響復制，重組和修復相關的和轉錄相關蛋白功能的非同義突變(如recD，Rv0922，dinG，uvrC和nth等)，這類突變正好也可以用來作為解釋lineage2相較于lineag

5、e4的易突變和耐多藥性的潛在突變機制。因此，這兩者型別相關的突變位點除了可作為將來高分辨率分型技術的分子標記，對于研究lineage2的易耐藥性、較高突變率和毒力具有一定的價值。
　　3.在依據系統發(fā)育樹推測結核分枝桿菌的起源和進化史時，我們發(fā)現結核分枝桿菌復合群的分化過程同現代人類的遷徙有著密切的聯系。追蹤結核分枝桿菌復合群的共同祖先，同樣是七萬年前左右走出非洲，并依此分化非洲分枝lineage5-6(6萬年前左右)，環(huán)印度洋分

6、枝 lineage1(5.8萬年前左右)、歐美分枝lineage4(3.7萬年前左右)，并最終3.4萬年前左右分化出中亞分枝lineage3和東亞分枝lineage2。
　　4.研究我國主要型別lineage2和lineage4在中國境內的可能歷史傳播軌跡時，我們推測亞型L2.1、L2.2、L2.3和L4.1、L4.2均是在一萬年前左右(新石器時代)發(fā)生了擴張和分化出來。其中，L2亞型中相對古老的L2.1很可能同東亞人早期的“南線

7、”從中國的南部地區(qū)出現有南至北的傳播。而 L2.2、L2.3、L4.1和L4.2更可能與東亞人的“北線”遷徙路徑有關，從中亞或西伯利亞等區(qū)域傳入中國并擴散，尤其是最“年輕”的L2.3的共同祖先(5.2千年前-1萬年前)很可能由于所處的年代(華夏五千年)或本身的進化優(yōu)勢(更強的毒力、適應性)，使L2.3成為如今中國地區(qū)的主要流行的型別。
　　5.在對臨床結核分枝桿菌的耐藥關聯分析中，首先根據進化樹去除與系統發(fā)育樹相關的或者是發(fā)生同義

8、突變的SNPs，然后通過泊松分布(P<0.05)和正態(tài)分布(P<0.01)計算，從剩余的突變基因/間隔區(qū)中篩選得到一批多突變位點、耐藥菌株中突變比率高的候選耐藥相關基因(85個)/間隔區(qū)(32個)，其中包含已知報道過的14個耐藥相關基因和4個耐藥相關間隔區(qū)。由于臨床上有聯合用藥的習慣，初步統計分析發(fā)現該藥物與藥物之間的關聯造成突變頻率高的那些已知耐藥基因與八種藥物都表現出一定關聯性，造成關聯分析的干擾。
　　6.針對已知報道耐藥基

9、因的進一步相關性分析(OR值和Fisher精確檢驗)發(fā)現，生長必需基因突變位點具有一定的偏好性，如rpoB的密碼子531和526突變，katG的315突變，這類集中突變的位點很可能是因為對生長必需基因帶來的影響小，帶給菌株的適應性代價低。相比之下，非必需基因ethA、pncA則表現為耐藥菌株中突變的位點較分散、種類多，無明顯的特異突變位點；已知報道的inhA和furA基因本身的突變則與異煙肼的耐藥性關聯性較弱，然而與異煙肼結構上類似的乙

10、硫異煙胺的耐藥性則與inhA基因和ethA基因的突變表現出了強關聯性；作為同樣作用于蛋白質合成的一線藥物鏈霉素和二線藥物卷曲霉素、卡那霉素相關的耐藥基因則所差異，耐鏈霉素的菌株以rpsL的突變?yōu)橹?，而編碼核糖體16S rRNA的rrs上1400位置的突變則更容易導致卷曲霉素和卡那霉素的耐藥性；embA和gyrB則分別在乙胺丁醇和氧氟沙星中耐藥性關聯遠不如embB和gyrA強。
　　7.在挖掘候選耐藥相關基因與藥物之間的關系中發(fā)現，

11、基因水平與耐藥機制的關聯性要比原本認為的要復雜，基于STITCH數據庫分析，除去已知報道的直接藥物靶基因突變，還包括間接的耐藥補償相關、細胞壁相關通路(fadD，pks和mmpL家族等)的基因；利用dN/dS分類計算，發(fā)現候選的耐藥相關基因在耐藥菌株中受到強烈的正向選擇(平均dN/dS>1.0，其中敏感菌株的全基因組平均dN/dS僅0.430)；85個候選耐藥基因中含24個結核分枝桿菌生長必需基因，這也很可能與長期的藥物刺激和強烈正向選

12、擇壓力有關；耐藥的候選間隔區(qū)存在通過sRNA或者新的啟動子區(qū)域突變來進行調控基因表達的可能。
　　綜上所述，本研究通過整合中國地區(qū)臨床菌株的測序結果，找到lineage2與lineage4型別相關的SNPs和一批耐藥候選區(qū)域，展示了結核菌同人類長期共進化、遷徙的關系以及在中國的歷史傳播軌跡，挖掘了一些新結核分枝桿菌的可能耐藥機制。本研究為更好預測結核未來的可能傳播模式并制定防控、跟蹤、診斷和治療方案提供幫助，同樣也為多組學的結核分