羊種布魯氏菌015株gmd、per和manb缺失株的構(gòu)建及診斷抗原反應(yīng)原性評價研究.pdf

1、布魯氏菌病是一種人畜共患疾病，對畜牧業(yè)和人類健康構(gòu)成了巨大威脅，被列為B類傳染病。目前還沒有人用布病疫苗，主要是通過布魯氏菌弱毒活疫苗接種動物來防控布病。目前大多數(shù)動物布病疫苗為光滑型的減毒活疫苗，毒副作用較大、無法區(qū)分自然感染和人工免疫等不足。布魯氏菌的致病機(jī)制還不完全清楚。脂多糖(LPS)是布氏桿菌非常重要的毒力因子，具有較強(qiáng)的抗原性。根據(jù)現(xiàn)有的研究表明，LPS的完整性與其胞內(nèi)存活、增殖和毒力等密切相關(guān)。gmd、per和manb都與

2、光滑型布魯氏菌的LPS的生物合成過程有關(guān)。這些基因的缺失可以導(dǎo)致光滑型布魯氏菌變?yōu)榇植谛筒剪斒暇?br>　　目的：本研究通過同源重組缺失了羊種布魯氏菌生物3型流行株015的gmd， per和manb基因，構(gòu)建相應(yīng)的粗糙型缺失株；并在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和昆明系小鼠體內(nèi)初步評價其毒力致弱情況，檢測了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平；同時分別表達(dá)了gmd，per和manb蛋白，Western blot驗(yàn)證其反應(yīng)原性；旨在為研發(fā)

3、能區(qū)分疫苗免疫和自然感染的羊種布魯氏菌標(biāo)記性疫苗提供基礎(chǔ)材料。
　　方法：本研究以羊種布魯氏菌015為模板，分別克隆gmd，per和manb基因的上、下游同源臂，以枯草芽孢桿菌為模板克隆SacB基因，將克隆得到的序列連接到pMDS19-T載體上，采用雙酶切法將上游同源臂、下游同源臂、SacB序列分別連到自殺載體pGEM-7Zf上，分別構(gòu)建了同源重組自殺載體pGEM-7Zf-Δgmd-SacB（pgs），pGEM-7Zf-Δper

4、SacB（pps）和pGEM-7Zf-Δmanb-SacB（pms），然后分別電轉(zhuǎn)至羊種布魯氏菌015感受態(tài)細(xì)胞中，通過多次篩選分別獲得015Δgmd，015Δper和015Δmanb基因缺失株；對獲得的缺失株進(jìn)行PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性等檢測。用穩(wěn)定遺傳的粗糙型缺失株分別侵染鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7和昆明系小鼠，通過載菌量（CFU）檢測缺失株毒力致弱情況；通過間接ELISA方法檢測了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。此外，用PC

5、R方法分別擴(kuò)增gmd，per和manb基因，將測序正確的基因序列分別克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3（BL21）中誘導(dǎo)表達(dá)。建立穩(wěn)定的表達(dá)gmd，per和manb蛋白的體系，用布魯氏菌自然感染綿羊血清進(jìn)行western blot檢測，最終篩選出有鑒別診斷意義的抗原蛋白。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的粗糙型羊種布魯氏菌015Δgmd，015Δper，015Δmanb缺失株，在20代內(nèi)沒有發(fā)生回復(fù)突變