結(jié)核分枝桿菌孤兒反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Rv0818基因缺失株的構(gòu)建及功能的初步研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中生存需要面對(duì)多種極端的環(huán)境，如缺氧、一氧化氮?dú)?、營(yíng)養(yǎng)缺乏等等。雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)對(duì)于結(jié)核分桿菌在這些極端環(huán)境中存活至關(guān)重要。目前對(duì)于雙組份調(diào)控系統(tǒng)孤兒反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Rv0818的功能及上游信號(hào)研究較少。本實(shí)驗(yàn)利用溫敏性噬菌體介導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌敲除方法構(gòu)建了Rv0818單基因缺失株。通過比較缺失株與野生株在固體平板上形態(tài)學(xué)特征、對(duì)于一氧化氮的耐受以及在巨噬細(xì)胞中的存活情況，觀察Rv0818缺失對(duì)結(jié)核分枝桿菌的影響。并通

2、過檢測(cè)Rv0818下游基因表達(dá)量變化，驗(yàn)證了Rv0818作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。本實(shí)驗(yàn)為結(jié)核病致病機(jī)理的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)給結(jié)核疫苗的研制提供了備選的基因缺失菌株。
　　1.結(jié)核分枝桿菌基因缺失株的構(gòu)建與鑒定
　　實(shí)驗(yàn)成功將Rv0818同源重組區(qū)域插入到分枝桿菌噬菌體中，并利用噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌得到了能在Hyg抗性平板上生長(zhǎng)的陽性克隆子。通過PCR鑒定和測(cè)序鑒定確定了目的基因被抗性區(qū)域替換，成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌基

3、因缺失株。
　　2.形態(tài)學(xué)特性比較
　　實(shí)驗(yàn)比較了野生株與突變株在固體平板上的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果顯示缺失株在固體平板上生長(zhǎng)形成更少的索狀結(jié)構(gòu)，而索狀結(jié)構(gòu)的形成與菌株的個(gè)體大小、生長(zhǎng)速率以及細(xì)胞壁外層結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，預(yù)示著Rv0818缺失株毒力的減弱。
　　3.NO耐受能力的比較
　　實(shí)驗(yàn)比較了野生株和缺失株在NO刺激條件下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示野生株與缺失株的生長(zhǎng)會(huì)受到高濃度NO的抑制。而野生株能夠更快從NO抑制作用中

4、恢復(fù)，說明Rv0818的缺失影響了菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。
　　4.胞內(nèi)存活能力的比較
　　實(shí)驗(yàn)比較了巨噬細(xì)胞對(duì)野生株與突變株的吞噬率，結(jié)果顯示缺失株更容易被巨噬細(xì)胞吞噬。實(shí)驗(yàn)還比較了菌株在感染細(xì)胞后24h、48h、72h的存活情況。結(jié)果顯示缺失株在胞內(nèi)活菌數(shù)基本不變，而野生株活菌數(shù)在感染72h時(shí)增加了3倍，說明Rv0818的缺失使菌株在胞內(nèi)的存活能力下降。
　　5.Rv0818下游基因表達(dá)量變化
　　實(shí)驗(yàn)比較了R