結(jié)核分枝桿菌哺乳動物細(xì)胞入侵因子mce家族Rv0590A基因的性質(zhì)及功能研究.pdf

1、結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，它是由結(jié)核分枝桿菌(Mvcobacterium tuberculosis)引起的一種慢性疾病。結(jié)核病發(fā)病率的增加在一些資源短缺國家甚至工業(yè)發(fā)達(dá)國家都已是不爭的事實(shí)。人們對(Mycobacteriumtuberculosis)的生物特性進(jìn)行廣泛研究，研發(fā)了鏈霉素、異煙肼、利福平等治療性藥物，使得人類對結(jié)核病的控制取得了可喜的成績。然而，化學(xué)藥物的不合理應(yīng)用，耐藥菌株的廣泛出現(xiàn)，M.tuberculos

2、is與人類免疫缺陷病毒HIV的共感染，人口流動的增加使得結(jié)核病疫情下降緩慢，在部分地區(qū)甚至有所回升。開發(fā)出對結(jié)核病有效的預(yù)防性、治療性疫苗和新型藥物是亟待解決的難題。尋找新的結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)和開發(fā)新型抗結(jié)核藥物己成為當(dāng)前最受關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 M.tuberculosis作為一種胞內(nèi)致病菌，主要存在于單核吞噬細(xì)胞內(nèi)。它的一個重要特征是能夠在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和增殖，并抑制吞噬小體的酸化和成熟。M.tuberculosis的基因組

3、包含4個哺乳動物細(xì)胞入侵因子(mce)操縱子(mcel-4)，每個mce操縱子含有8-13個基因，它們相互毗連且在各操縱子中排列相似。每個操縱子中相對應(yīng)的基因具有相似的序列及有機(jī)組成，編碼與M.tuberculosis入侵以及在宿主巨噬細(xì)胞中存活相關(guān)的輸出蛋白。mce基因使得重組非致病菌E.coli能夠入侵哺乳動物并在其巨噬細(xì)胞中存活，與M.tuberculosis入侵宿主細(xì)胞并在其巨噬細(xì)胞內(nèi)的持久存活有著密切的關(guān)系。Rv0590A作為

4、mce操縱子上一個未知功能的ORF，是mce2操縱子上一個獨(dú)有的基因，可能與Mce2R共同調(diào)控mce2的表達(dá)。Rv0590A與mce2B組成M.tuberculosis H37Rv的一個中斷編碼序列(ICDS)，與其他18個ICDS共同構(gòu)成M.tuberculosis和Mycobacterium bovis(M.boris)分化的依據(jù)之一。
　　 本研究通過生物信息學(xué)對結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv0590A基因的性質(zhì)及功能進(jìn)行研

5、究，并對該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析和預(yù)測，以期為該蛋白的研究提供生物信息學(xué)相關(guān)的參考依據(jù)。運(yùn)用TMHMM Serverv.2.0，Jpred，VectorNTI9，Clustal X，SignalP，swiss model等生物信息學(xué)資源對Rv0590A的基本性質(zhì)進(jìn)行了分析，包括對蛋白一級結(jié)構(gòu)(親水性/疏水性，跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽等)，二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)等基本性質(zhì)的預(yù)測分析。結(jié)果表明：結(jié)核分枝桿菌H37RvRv0590A編碼蛋白無

6、信號肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)；其二級結(jié)構(gòu)是由2個α螺旋及2個β折疊片構(gòu)成。同時(shí)在一、二級結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，利用同源建模的方法完成了其三維結(jié)構(gòu)的建模。運(yùn)用http：//string.embl.de/軟件預(yù)測Rv0590A蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明與其相互作用蛋白主要是同源及與其毗鄰的蛋白即mce2操縱子所編碼的蛋白及其調(diào)節(jié)子Rv0586。與報(bào)道的Rv0590A可能與Rv0586共同調(diào)節(jié)mce2的轉(zhuǎn)錄相互印證。利用比較基因組學(xué)分析該蛋白在分枝桿

7、菌屬中的同源和分布情況，結(jié)果表明該基因在進(jìn)化上相對保守。
　　 從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv0590A基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)兩對引物，分別以結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組為模板，分別體外擴(kuò)增獲得Rv0590A基因。分別通過TA克隆，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T SimpleVector，分別亞克隆至載體pET28a(+)和pcDNA3.1(+)中，經(jīng)菌落PCR以及序列測定證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pE

8、T28/Rv0590A和pcDNA3.1/Rv0590A。將重組質(zhì)粒pET28/Rv0590A轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE3)，對該重組蛋白質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用Ni+凝膠親和層析方法純化獲得高純度的重組Rv0590A蛋白，weaern bloting驗(yàn)證Rv0590A融合表達(dá)。我們研究了過表達(dá)該蛋白對宿主菌的影響，包括過表達(dá)Rv0590A對宿主菌生長，脂肪酸組成以及對宿主菌抗氧化壓力的耐受性研究。將重