結(jié)核分枝桿菌耐受表面活性物質(zhì)SDS的基因Rv0621的性質(zhì)及功能的深入研究.pdf

1、結(jié)核病一直在全球廣泛流行,嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康,其病原菌——結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)在1882年被德國(guó)科學(xué)家科赫首次鑒定。20世紀(jì)40年代以后,隨著抗結(jié)核藥物的問(wèn)世和卡介苗的預(yù)防接種,結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率均明顯下降。但隨著耐藥菌株的出現(xiàn)、人口老齡化、人類(lèi)免疫缺陷病毒感染者的增多和免疫抑制劑的應(yīng)用日益普遍,結(jié)核病又呈蔓延趨勢(shì)。結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入人體后可能會(huì)引起原發(fā)性結(jié)核病,也有可能會(huì)在人體

2、內(nèi)持續(xù)感染而不引起被感染者明顯的癥狀,當(dāng)宿主免疫力低下時(shí),潛伏性結(jié)核會(huì)被激活為活動(dòng)性結(jié)核。結(jié)核分枝桿菌的持續(xù)感染與其有效抵抗宿主體內(nèi)的各種脅迫因素有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌經(jīng)呼吸道進(jìn)入人體肺部時(shí),將面臨多種不利因素的脅迫,例如氧化壓力、營(yíng)養(yǎng)缺乏、低氧、低pH值、肺部表面活性物質(zhì)等。
　　 為了研究結(jié)核分枝桿菌抵抗肺部表面活性物質(zhì)脅迫相關(guān)基因,實(shí)驗(yàn)室前期工作利用大腸桿菌基因組文庫(kù)篩選到了抵抗肺部表面活性物質(zhì)類(lèi)似物十二烷基硫酸鈉SDS的相關(guān)

3、基因Rv0621,該基因編碼結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)37kDa蛋白,經(jīng)疏水性分析,推測(cè)其為具有四個(gè)跨膜區(qū)的跨膜蛋白,并具有ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)的保守結(jié)構(gòu)域。我們?cè)诮Y(jié)核分枝桿菌的無(wú)毒模式菌株——恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)中進(jìn)行了Rv0621的性質(zhì)及功能研究,以期尋找Rv0621抵抗肺部表面活性物質(zhì)的機(jī)理。
　　 本研究中,從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得MTB H37Rv Rv0621的核苷酸序列,設(shè)計(jì)引

4、物,以MTB H37Rv全基因組為模板,體外擴(kuò)增獲得Rv0621基因,將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T,然后亞克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)和大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pNIT(myc),經(jīng)質(zhì)粒雙酶切及測(cè)序證明pET32a(+)-Rv0621和pNIT(myc)-Rv0621重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌和恥垢分枝桿菌,分別用IPTG和己內(nèi)酰胺進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),用SDS-PAGE和Western-Blot檢測(cè)了重組

5、蛋白的表達(dá)。為了驗(yàn)證Rv0621編碼的蛋白是否會(huì)增加恥垢分枝桿菌在SDS下的存活率,用MTT法研究了重組菌在0.5%SDS下的存活能力。結(jié)核分枝桿菌作為一種重要的病原微生物,其細(xì)胞被膜有著獨(dú)特的組成和結(jié)構(gòu),可以通過(guò)屏蔽或外排藥物導(dǎo)致該菌的耐藥性,所以我們用藥敏法研究了Rv0621編碼的這一膜蛋白對(duì)恥垢分枝桿菌耐受結(jié)核藥物能力的影響。SDS能破壞結(jié)核分枝桿菌富含脂肪酸的細(xì)胞被結(jié)構(gòu),Rv0621可能會(huì)改變宿主的脂肪酸組分以應(yīng)對(duì)這一破壞,所以

6、我們通過(guò)氣相色譜檢測(cè)了重組菌與空載對(duì)照的脂肪酸組成差異并檢測(cè)了導(dǎo)致該差異的基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Rv0621在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中成功異源表達(dá),Rv0621過(guò)表達(dá)對(duì)恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)速率影響不顯著,重組恥垢分枝桿菌在0.5%SDS下的存活率增加,對(duì)結(jié)核藥物尤其是利福平的耐受增加,重組恥垢分枝桿菌和空載對(duì)照菌的脂肪酸組分存在較大差異,重組恥垢分枝桿菌的十六烷酸和十八烷酸減少,相應(yīng)的不飽和脂肪酸十六碳烯-9-酸和十

7、八碳烯-9-酸增加,經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)引起該脂肪酸變化的酶的編碼基因MSMEG2938和MSMEG5248的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。肺泡表面活性物質(zhì)能破壞結(jié)核分枝桿菌富含脂肪酸的細(xì)胞被結(jié)構(gòu),而不飽和脂肪酸是微生物的重要組分,在微生物抵抗外界壓力中發(fā)揮著重要作用。我們推測(cè)Rv0621重組恥垢分枝桿菌不飽和脂肪酸的增加可能會(huì)改變其細(xì)胞膜的成分及功能,從而應(yīng)對(duì)SDS對(duì)恥垢分枝桿菌細(xì)胞膜產(chǎn)生的破壞,并對(duì)結(jié)核藥物產(chǎn)生屏蔽或外排,影響其進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用