哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)載體的優(yōu)化.pdf

1、哺乳動(dòng)物細(xì)胞由于有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等可用于進(jìn)行蛋白質(zhì)糖基化的結(jié)構(gòu)和機(jī)制以及具有與人十分相似的糖基化方式，它表達(dá)的蛋白質(zhì)往往具有天然蛋白的構(gòu)象及生物學(xué)特性，這是大腸桿菌、酵母及昆蟲(chóng)表達(dá)所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。但是，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也面臨外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)水平低、獲得高表達(dá)細(xì)胞株的時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。解決這些問(wèn)題的至關(guān)重要的一步是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建及其進(jìn)一步優(yōu)化，因此本研究以CHO-dhfr-細(xì)胞為宿主細(xì)胞，從目的基因表達(dá)單元的優(yōu)

2、化和篩選基因的弱化兩個(gè)方面對(duì)構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行優(yōu)化。 本研究以pMCEd-k2tPA載體為基礎(chǔ)對(duì)目的基因表達(dá)單元中的表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行優(yōu)化研究，使用的表達(dá)調(diào)控元件有：hCMV和hEF-1α啟動(dòng)子、hCMVEnhancer、hEF-1α1stintron以及翻譯增強(qiáng)子H213和V163。k2tPA是tPA的一種突變體，可以通過(guò)溶圈法測(cè)定它的表達(dá)水平，遂以k2tPA為報(bào)告基因構(gòu)建了8個(gè)含有不同表達(dá)調(diào)控元件組合的定點(diǎn)整合型

3、表達(dá)載體。然后在定點(diǎn)整合型表達(dá)系統(tǒng)中比較不同載體轉(zhuǎn)染CHO-dhfr--Z+細(xì)胞形成克隆的k2tPA表達(dá)水平，進(jìn)而比較這些不同表達(dá)調(diào)控元件的表達(dá)效率并篩選到了兩種表達(dá)效率有明顯提高的表達(dá)調(diào)控元件組合：hCMV啟動(dòng)子與H213以及hEF-1α啟動(dòng)子與V163組合的表達(dá)效率分別是僅含hCMV啟動(dòng)子的156.6％和139.5％。 同時(shí)，本研究中以Neo基因?yàn)楹Y選基因，采用多種方式對(duì)其進(jìn)行弱化，具體的弱化方式有：在Neo基因的起始密碼

4、子前添加不同閱讀框架的ATG/改變其Kozak序列、將Neo基因置于內(nèi)含子中以及使用活性降低的突變體?；谏鲜霾煌娜趸绞綐?gòu)建了6個(gè)隨機(jī)整合型載體(e、f、g、h、t和u)，通過(guò)隨機(jī)整合的方法，以這些載體轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞后的克隆形成率以及克隆的k2tPA混合表達(dá)水平為指標(biāo)，比較了不同弱化方式的篩選效率。所構(gòu)建的載體都明顯低于通用的商業(yè)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的克隆形成率，其中e、f的克隆形成率分別為：11

5、5Colonies/2.0×105Cells和62Colonies/2.0×105Cells；初步評(píng)價(jià)了g、h、t和u的篩選效率，g和h在轉(zhuǎn)染2.0×106Cells時(shí)沒(méi)形成克隆，t的克隆形成率(10Colonies/2.0×106Cells)比u的要低一個(gè)數(shù)量級(jí)。 本研究在目的基因表達(dá)單元的優(yōu)化和篩選基因Neo基因的弱化方面都獲得了較理想的結(jié)果，為進(jìn)一步研究不同表達(dá)調(diào)控元件間的相互作用、實(shí)現(xiàn)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)