哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293-F瞬時(shí)表達(dá)人IL-4.pdf

1、自1982年美國(guó)FDA批準(zhǔn)首個(gè)基因工程藥物——重組人胰島素上市之后，以重組蛋白藥物為首的基因工程藥物在近三十年來(lái)發(fā)展迅速。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞能對(duì)蛋白進(jìn)行正確的折疊組裝和翻譯后修飾，這對(duì)于蛋白維持構(gòu)象的穩(wěn)定和生物活性的發(fā)揮是至關(guān)重要的，因此哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)成為生產(chǎn)重組蛋白藥物的首選工具。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)以其生產(chǎn)周期短，效率高，低投入的特點(diǎn)成為表達(dá)研發(fā)過(guò)程中的藥物蛋白候選基因或是結(jié)構(gòu)、功能不明確的蛋白基因的最佳選擇，是一種快速、便捷的蛋白表達(dá)方法

2、。
　　 雖然瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)廣泛用于重組蛋白藥物的篩選和蛋白功能的研究，但是相對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)前者在蛋白表達(dá)水平上還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后的。因此需要深入研究如何提高瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)量。
　　 白細(xì)胞介素4(Interleukin-4，IL-4)是免疫系統(tǒng)效B和T淋巴細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞成熟分化所必需細(xì)胞因子，除了在介導(dǎo)炎癥過(guò)敏反應(yīng)中發(fā)揮作用外，在腫瘤、自身免疫等疾病的治療和研究中都有重要作用。天然人IL-4分子為由129個(gè)氨基酸(1

3、5 kDa)構(gòu)成的蛋白質(zhì)，糖基化在其肽鏈骨架上的2個(gè)糖基化位點(diǎn)引入，分子內(nèi)二硫鍵由其肽鏈上的6個(gè)半胱氨酸參與。目前基因重組IL-4主要是采用E.coli表達(dá)，為非糖基化蛋白質(zhì)，雖然保留了生物活性，但其活性和穩(wěn)定性應(yīng)該與其糖基化形式有很大差異。另外，采用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，由多個(gè)半胱氨酸參與的分子內(nèi)二硫鍵形成不存在錯(cuò)配問(wèn)題。
　　 本文以人IL-4作為研究對(duì)象，首先克隆構(gòu)建了人IL-4真核表達(dá)載體，將幾種分泌能力強(qiáng)的信號(hào)肽編碼序列通過(guò)P

4、CR方法與IL-4基因融合，它們分別為鼠抗體kappa輕鏈可變區(qū)的信號(hào)肽--Ig k-chain signal peptide，海洋橈足動(dòng)物的熒光素酶的信號(hào)肽--Gaussia luciferase signal peptide，和一種人工信號(hào)肽，構(gòu)建了一系列帶有不同信號(hào)肽的表達(dá)載體。將這幾種表達(dá)載體通過(guò)PEI介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在HEK293-F細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行優(yōu)化。用ELISA的方法來(lái)定量檢測(cè)IL-4的分泌表達(dá)量，得出結(jié)果熒光

5、素酶信號(hào)肽分泌表達(dá)IL-4的能力最強(qiáng)。
　　 然后選取熒光素酶信號(hào)肽構(gòu)建的表達(dá)載體，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)15組不同組合的實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析(RSM)建立了DNA濃度，PEI濃度和孵育時(shí)間三個(gè)影響因子與IL-4表達(dá)量之間的多元線性回歸模型：
　　 Y=198.02+32.77*A-54.25*B-7.90℃-4.55*A*B-4.68*A℃+11.47*B*C+2.74*A2-117.