RNA干擾技術(shù)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中報(bào)告基因、端粒酶相關(guān)基因的表達(dá)抑制研究.pdf

1、本研究選用半衰期僅1h的非穩(wěn)定型載體pd1EGFP、表Luciferase的pGL3-control及表達(dá)紅色熒光蛋白的pdsRed2為靶載體，構(gòu)建了一系列pAVU6+27-shRNA表達(dá)載體。通過設(shè)計(jì)一系列RNAi實(shí)驗(yàn)控制，將上述載體共轉(zhuǎn)染于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，運(yùn)用RT-PCR及Westernblot半定量檢測(cè)mRNA及蛋白的表達(dá)，以確定其干擾效率。本研究結(jié)果表明：①pAVU6+27是一種高效的shRNA表達(dá)載體，其U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄小發(fā)夾R

2、NA介導(dǎo)的RNAi可以顯著降低體外增殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中相應(yīng)序列基因的表達(dá)，而且這種抑制作用呈現(xiàn)高效性、特異性特征；②RNAi具有明顯的“靶點(diǎn)效應(yīng)”，即基因編碼區(qū)不同位置的siRNA序列可以介導(dǎo)不同抑制效應(yīng)的RNAi，提示RNAi效率的大小不僅取決于RNA與靶mRNA結(jié)合的能力，還與結(jié)合的靶序列本身有關(guān)；③共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同shRNA表達(dá)載體兩兩間沒有相互增強(qiáng)或減弱的RNAi干擾效應(yīng)。提示在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，基于載體表達(dá)的RNAi呈

3、現(xiàn)一定的“閾值”效應(yīng)；④體外增殖的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，shRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染能顯著抑制瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)的外源報(bào)告基因、內(nèi)源性基因的表達(dá)。其RNAi效應(yīng)在一定時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)由弱到強(qiáng)、又由強(qiáng)到弱的逐漸消逝趨勢(shì)，表現(xiàn)為明顯的時(shí)間依賴性效應(yīng)；⑤在一定劑量范圍內(nèi)，shRNA干擾載體所介導(dǎo)的抑制效應(yīng)與干擾載體劑量大小有關(guān)，當(dāng)其劑量進(jìn)一步加大足以抑制外源基因表達(dá)時(shí)，抑制效應(yīng)則維持在一“平臺(tái)期”，表現(xiàn)為一定范圍內(nèi)的劑量依賴性效應(yīng)；⑥D(zhuǎn)icer酶基因是shR