端粒酶RNA基因突變對Hela細(xì)胞生長的作用.pdf

1、端粒是染色體末端的DNA-蛋白復(fù)合物,具有穩(wěn)定染色體末端的作用。端粒長度的維持和端粒酶活性的激活是大多數(shù)癌變過程必須的,端粒相關(guān)蛋白及端粒酶RNA的突變都能夠?qū)е露肆Ｃ被δ軉适亩鴮?dǎo)致基因組的不穩(wěn)定。隨著細(xì)胞的分裂出現(xiàn)染色體的重組,斷裂-融合-橋循環(huán),其中端粒酶可能是最關(guān)鍵的因素之一。端粒酶的概念于20世紀(jì)80年代被提出,端粒酶是一個(gè)大的核糖核蛋白反轉(zhuǎn)錄酶,以自身RNA為模板將端粒重復(fù)序列添加到染色體末端維持端粒的長度。端粒酶的必需組

2、件包括反轉(zhuǎn)錄酶TERT,端粒酶RNA(TERC)和TERC結(jié)合蛋白dyskerin。直到近幾年研究才發(fā)現(xiàn)端粒酶活性及端粒穩(wěn)定與惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)。端粒酶在正常人體細(xì)胞中檢測不到活性,但在85％的人腫瘤細(xì)胞中上調(diào),因此成為腫瘤標(biāo)志物。
　　 本論文以端粒酶RNA亞基為靶標(biāo),在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞中引入帶突變模板的人端粒酶RNA亞基(MT-hTER)是一種新穎的抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法。本論文通過構(gòu)建pcDNA3.1(-)-hTER重組

3、真核表達(dá)載體,觀察其對人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長的影響。通過重疊延伸PCR及分子克隆技術(shù)構(gòu)建野生型及突變型hTER表達(dá)重組體,將重組體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,經(jīng)藥物G418的篩選得到穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞。RT-PCR檢測目的基因的表達(dá),并通過MTT法繪制各組細(xì)胞的生長曲線,Hoechst33342染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組體在細(xì)胞內(nèi)能成功表達(dá)目的基因,構(gòu)建的兩個(gè)MT-hTER重組體能使HeLa細(xì)胞生長

4、速度明顯減緩。以上結(jié)果提示,在HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)MT-hTER能抑制細(xì)胞的生長速度,并且突變模板的設(shè)計(jì)可能會影響到抑制效應(yīng)的發(fā)揮。一方面,端粒酶RNA亞基模板區(qū)突變,導(dǎo)致突變的端粒重復(fù)序列添加到染色體末端,從而影響端粒序列結(jié)合蛋白的對端粒DNA的親和性,使端粒帽化功能喪失,從而出現(xiàn)染色體融合和基因組不穩(wěn)定,啟動細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn),導(dǎo)致細(xì)胞走向衰老和死亡。另一方面,端粒酶RNA亞基的突變影響了其與hTERT的結(jié)合,或是影響端粒酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定