ABCA1基因?qū)Σ溉閯游锛毎股樾杂绊懙难芯?pdf

1、目的：本課題運用分子生物學(xué)方法,研究ABCA1基因表達增高和降低后哺乳動物細胞株抗砷性的變化,同時觀察細胞內(nèi)砷含量的變化,從而確定ABCA1基因的抗砷功能,并推測其可能的抗砷機制。 方法：在Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染劑的介導(dǎo)下,將含有ABCA1基因的真核表達載體轉(zhuǎn)染入HeLa細胞,實時熒光定量PCR(real-time PCR)方法檢測轉(zhuǎn)染后目的基因mRNA水平：用蛋白質(zhì)免疫印記法(Western-blot)檢測轉(zhuǎn)

2、染后ABCA1蛋白水平的改變,從而確定轉(zhuǎn)染效率,通過噻唑蘭法(MTT)檢測48h急性砷染毒后光密度值(OD)值計算生存率及半數(shù)抑制濃度(IC50),分析細胞抗砷性的變化,然后運用原子熒光分光光度法(AFS)檢測細胞內(nèi)砷蓄積量的變化。同時,利用RNA干擾技術(shù)將ABCA1的小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染入抗砷細胞ECV-304中,Western-blot檢測干擾后ABCA1蛋白水平的改變,確定干擾效率,然后通過噻唑蘭法檢測48h急性砷染

3、毒后OD值計算生存率及IC50,分析細胞抗砷性的變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染48h后的real-time PCR結(jié)果顯示所有標(biāo)本的管家基因GAPDH和ABCA1均可見較標(biāo)準(zhǔn)的擴增曲線,無非特異擴增。各組ABCA1及GAPDH Ct值比較結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1/ABCA1在HeLa胞中ABCA1的表達量是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His組的22.6倍,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His組與未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞A

4、BCA1表達量無明顯差異；Western-blot結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組在254 KD處均有特異性蛋白條帶,其大小與ABCA1蛋白大小相符,且重組質(zhì)粒組蛋白表達量明顯高于轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組。這說明pcDNA3.1/ABCA1重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入HeLa細胞并使ABCA1蛋白在HeLa細胞中呈高表達狀態(tài)。轉(zhuǎn)染后急性砷染毒48h用噻唑蘭法計算生存率及IC50,結(jié)果顯示實驗組細胞在各種砷濃度下生存率均高于同步對照組細胞,兩組生存

5、率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組IC50為36.740μmol/l高于對照組IC50為20.721μmol/l。原子熒光分光光度法結(jié)果顯示,ABCA1蛋白高表達后,HeLa細胞內(nèi)砷含量在各時間段均低于對照組細胞,且4小時候后細胞內(nèi)砷蓄積量趨于穩(wěn)定,而對照組細胞內(nèi)砷蓄積量持續(xù)增加?？股榧毎鸈CV-304經(jīng)siRNA干擾后,實驗組ABCA1蛋白表達量明顯低于陰性對照組,呈低表達狀態(tài),干擾后急性砷染毒48h,結(jié)果顯示實驗組細胞在各種砷濃度下生存率均