基于AID酶與哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)的抗PD-1抗體體外進(jìn)化研究.pdf

1、研究背景：抗體作為一種特異性強(qiáng)、安全性高、效果顯著的藥物，在腫瘤等多種疾病的臨床治療中發(fā)揮重要作用。在多種抗體制備技術(shù)中，抗體庫(kù)技術(shù)是最常用的技術(shù)之一?；罨T導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase AID）參與B細(xì)胞受體親和力成熟，促進(jìn)并誘導(dǎo)免疫球蛋白可變區(qū)的突變，在抗體體內(nèi)成熟過程中發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，在抗體庫(kù)中引入 AID酶，有助于提高抗體庫(kù)庫(kù)容。因此，AID酶與抗體庫(kù)技術(shù)

2、相結(jié)合的抗體篩選技術(shù)成為當(dāng)前抗體篩選的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
　　免疫負(fù)調(diào)控的共刺激信號(hào)通路 PD-1/PD-L1在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用，PD-1、PD-L1并成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)?？筆D-1/PD-L1的抗體藥物也成為了新的研究熱點(diǎn)。
　　目的：在課題組前期搭建的“哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示抗體庫(kù)技術(shù)”基礎(chǔ)上，本研究以PD-1為靶點(diǎn)，將抗體庫(kù)技術(shù)與 AID酶誘導(dǎo)抗體基因體外進(jìn)化成熟相結(jié)合，借助流式細(xì)胞分選技術(shù)，探討了一種高通

3、量的抗體篩選新方法。
　　方法：通過IMGT獲得抗PD-1抗體Nivolumab的可變區(qū)氨基酸序列，合理考察密碼子偏性的前提下進(jìn)行反向翻譯獲得可變區(qū)基因序列；通過全合成制備 Nivolumab的輕重鏈基因，并克隆入 pFRT-IgG1載體中進(jìn)行表達(dá)，全抗體命名為 MIL75。將 MIL75抗體 Fab片段克隆至 pFRT-FTMK載體上，該載體在抗體 Fab片段的重鏈 C末端偶聯(lián)了 PDGFR-α跨膜區(qū)，使抗體Fab片段能夠展示在

4、細(xì)胞膜上。通過真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體轉(zhuǎn)染到CHO-K1-FRT細(xì)胞中并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，進(jìn)一步將含有AID酶基因的載體轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中。利用FITC標(biāo)記的PD-1抗原（PD-1-FITC），通過流式分選的方法篩選高親和力的抗體。將富集到的細(xì)胞提取基因組，調(diào)取抗體基因經(jīng)測(cè)序并克隆到全長(zhǎng)抗體表達(dá)載體 pFRT-IgG1上進(jìn)行表達(dá)。隨后對(duì)篩選得到的抗體進(jìn)行了初步功能評(píng)價(jià)：（1）利用 ELISA和 Biacore的方法評(píng)價(jià)了抗體與抗原結(jié)合

5、的特異性和親和力；（2）針對(duì)篩選獲得的高親和力抗體，借助混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，通過檢測(cè) T細(xì)胞分泌 IFN-γ的水平來(lái)評(píng)價(jià)抗體激活 T細(xì)胞的功能；（3）在免疫缺陷 NPG小鼠中輸注人 PMBC，構(gòu)建 GVHD模型，進(jìn)一步給予抗 PD-1抗體，通過免疫排斥反應(yīng)的強(qiáng)弱評(píng)價(jià)抗體體內(nèi)生物學(xué)活性。
　　結(jié)果：（1）將全合成的抗體可變區(qū)基因分別克隆入載體 pFRT-IgG1以及 pFRT-FTMK中，成功構(gòu)建MIL75全長(zhǎng)抗體表達(dá)載體 pFR

6、T-IgG1K-MIL75以及Fab抗體細(xì)胞膜展示載體 pFRT-FTMK-MIL75Fab。pFRT-IgG1K-MIL75穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 CHO-K1-FRT細(xì)胞后，經(jīng)過加壓篩選，獲得了 MIL75全長(zhǎng)抗體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。ELISA結(jié)果表明，表達(dá)的 MIL75抗體可以特異性、高親和力識(shí)別 PD-1抗原。pFRT-FTMK-MIL75Fab穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 CHO-K1-FRT細(xì)胞后，經(jīng)過加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá) MIL75-Fab的細(xì)胞株。

7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，MIL75-Fab成功展示在 CHO-K1-FRT細(xì)胞表面，且能與抗原 PD-1的特異性結(jié)合并具有濃度依賴性；進(jìn)一步轉(zhuǎn)染入 AID酶誘導(dǎo)突變。（2）經(jīng)流式篩選及計(jì)算機(jī)序列比對(duì)分析后獲得三條新的抗體序列，分別為 Fv56、Fv60、Fv70。（3）體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明Fv56、Fv60、Fv70三株抗體均能夠與靶抗原PD-1特異性結(jié)合；其中，F(xiàn)v56、Fv60識(shí)別的表位與 MIL75相同；Fv70識(shí)別的表位發(fā)生了漂移。

8、抗體 Fv56、Fv60在體外能夠特異性阻斷 PD-1與 PD-L1相互作用。進(jìn)一步的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)表明：Fv56、Fv60與母本抗體 MIL75具有相似的生物學(xué)活性，均能夠激活T細(xì)胞，上調(diào) T細(xì)胞分泌 IFN-γ，并具有一定的抗體濃度依賴性；而 Fv70只在高濃度下對(duì) T細(xì)胞具有激活功能。（4）體內(nèi)生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗體 Fv56能夠激活人源化小鼠體內(nèi)的T細(xì)胞，加劇免疫排斥反應(yīng)，縮短了小鼠的生存時(shí)間。
　　結(jié)論：本研究將哺乳