山羊重組促卵泡素（FSH）在哺乳動物細胞內(nèi)瞬時和穩(wěn)定表達研究.pdf

1、重組FSH能夠避免天然激素制劑在應用過程中的不足,體外重組表達FSH為新型激素制劑的生產(chǎn)帶來了契機. 該研究根據(jù)已克隆的山羊FSHα、β基因cDNA序列,構(gòu)建山羊重組FSH真核表達載體,在哺乳動物細胞內(nèi)進行了體外瞬時和穩(wěn)定表達,為重組制劑的研制提供必備條件.構(gòu)建山羊FSHα、β亞基真核表達載體并在COS-7細胞中瞬時表達.以pGEM-T-FSHβ為模板,PCR擴增FSHβ基因,通過載體與目的基因的雙酶切及DNA連接,將FSHβ基因插入到

2、真核表達載體pcDNA3.0,構(gòu)建成pcDNA-FSHβ.從山羊腦垂體組織中提取總RNA,利用RT-PCR技術(shù)成功擴增出FSHα cDNA序列.經(jīng)與pcDNA3.o的酶切連接,構(gòu)建成表達載體pcDNA-FSHα.兩載體經(jīng)序列測定表明插入的目的基因序列完全正確.用PolyFect轉(zhuǎn)染試劑將兩載體轉(zhuǎn)入COS-7細胞進行瞬時表達,用放射免疫檢測表達上清和細胞裂解液,有重組FSH表達,但表達效率不高.提示要獲得高分泌重組產(chǎn)物,必須將α、β基因插

3、入同一載體共表達.構(gòu)建山羊FSHα、β雙表達載體,在CHO細胞中穩(wěn)定表達.設計含有酶切位點和Kozak序列的PCR特異引物,分別以pcDNA-FSHα、pcDNA-FSHβ為模板,PCR擴增FSHα、β基因.α、β基因與載體pVITRO-2用限制性內(nèi)切酶酶切、DNA連接酶連接,成功構(gòu)建山羊FSHα、β雙表達載體pVITRO-FSHαβ.基因序列測定表明插入序列完全正確.載體用PolyFect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染CHO細胞,經(jīng)潮霉素B抗性篩選,獲

4、得穩(wěn)定表達山羊FSH的CHO細胞.提取穩(wěn)定表達的CHO細胞基因組DNA,PCR檢測,表明山羊FSHα、β基因穩(wěn)定整合到CHO基因組中.培養(yǎng)上清FSH放射免疫檢測,發(fā)現(xiàn)有重組FSH的分泌. 該實驗首次成功構(gòu)建了山羊FSHα、β真核表達載體pcDNA-FSHα、pcDNA-FSHβ及雙表達載體pVITRO-FSHαβ;在COS-7和CHO細胞中得到了表達,并獲得了穩(wěn)定表達山羊FSH的CHO細胞.為重組FSH制劑生產(chǎn)及長效激素的研究奠定了基礎