可調(diào)式光遺傳學系統(tǒng)構(gòu)建及調(diào)控哺乳動物細胞內(nèi)信號通路的研究.pdf

1、光遺傳學技術(shù)利用基因編碼蛋白質(zhì)表達并結(jié)合光控和激光成像的手段為生物學研究提供了一種全新、無損、可逆、非侵入、超高時空分辨率的研究方法。光遺傳學的早期主要以神經(jīng)科學研究為主，利用第一代光遺傳學元件選擇性地觀察和控制腦中某類細胞的特定神經(jīng)活動，并取得了前所未有的成果。而近年來隨著不同種類的光遺傳學元件不斷地被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)出來，其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷地擴展。利用光遺傳學研究信號轉(zhuǎn)導成為時下熱門研究方向，通過光控蛋白的變構(gòu)、寡聚和解聚來達到人為控制細

2、胞內(nèi)信號蛋白的活性進而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導的目的，為人們研究細胞信號通路提供了極大的便利。除此之外，與其配套的研究工具:顯微成像系統(tǒng)，光刺激系統(tǒng)以及相應(yīng)的數(shù)學分析方法也如雨后春筍一般涌現(xiàn)出來，這些工具的出現(xiàn)更是使得光遺傳學的研究蓬勃發(fā)展起來。
　　目前，利用基因工程和蛋白工程發(fā)現(xiàn)和改造的光遺傳學元件大致分為六類。這些元件中的光敏蛋白吸收光子能量后發(fā)生光化學反應(yīng)，通過變構(gòu)和蛋白間的相互作用來控制標靶蛋白的互作和定位。研究者利用這些模塊化的工

3、具可以實現(xiàn)光控細胞內(nèi)多條信號通路以及多種生理活動的目的。
　　在此背景下，本文首先自行開發(fā)和搭建了一套可調(diào)式LED光刺激系統(tǒng)，利用CRY2/CIBN這對光遺傳學元件結(jié)合環(huán)狀TIRFM顯微成像，實現(xiàn)可調(diào)式光控細胞內(nèi)PI3K（Phosphoinositide3-kinase）/PI(3，4，5)P3/Akt信號通路的研究，最后將這套系統(tǒng)運用到A549肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitio

4、n，EMT)的調(diào)控研究當中，課題的主要研究工作如下:
　　(1)查閱文獻，探討實驗可行性。在開展課題前閱讀大量文獻，了解國內(nèi)外最新研究動態(tài)，對各研究優(yōu)缺點進行總結(jié)和討論分析。確定本課題的研究思路，提出一種基于CRY2/CIBN元件的可調(diào)式光遺傳學研究方法，以及確定使用LED照明矩陣作為體外大規(guī)模光刺激的輔助照明工具，并結(jié)合時下腫瘤研究領(lǐng)域熱門的EMT作為應(yīng)用切入點，進行應(yīng)用研究。最后，對本課題的可行性進行理論分析，并得出理論依據(jù)。

5、
　　(2)設(shè)計并搭建LED光刺激系統(tǒng)。基于前面的文獻查閱以及理論分析，在低成本、低功耗、便捷和穩(wěn)定的條件下，設(shè)計搭建LED光刺激系統(tǒng)。選取460nn-465 nm的藍光LED燈珠作為光源，搭建一個4×4LED矩陣。使用STC89C52作為整個硬件裝置的MCU，焊接硬件電路。使用Visual C++6.0編寫上位機控制程序，通過設(shè)置不同參數(shù)來操控LED矩陣的刺激模式。最后利用藍牙連接上位機與下位機，實現(xiàn)無線通信，以便于在培養(yǎng)箱中使

6、用該刺激系統(tǒng)。
　　(3)在Hela細胞中實現(xiàn)可調(diào)式CRY2/CIBN元件調(diào)控PI3K/PI(3，4，5)P3/Akt信號通路。設(shè)計實驗方案，確定不同刺激強度的LED照明刺激方案，確定顯微成像時間，以及拍攝細胞曝光時間和信號時序。培養(yǎng)細胞進行轉(zhuǎn)染，在單細胞情況下利用環(huán)狀TIRFM成像研究細胞內(nèi)PI(3，4，5)P3水平與光照強度的關(guān)系。大規(guī)模LED刺激下，利用免疫熒光和蛋白電泳等技術(shù)分析細胞內(nèi)Akt磷酸化水平與光照強度的關(guān)系。