哺乳動物工程細胞懸浮適應-可貼壁亞群(HEK293ar)的獲得及其抗失巢凋亡機制研究.pdf

1、目的：
　　通過建立導致HEK293細胞脫離培養(yǎng)時完全“失巢”的培養(yǎng)模型，首先通過包括電鏡觀察、TUNEL染色、流式檢測、Hoechst33342-PI雙染色等多種方法研究HEK293細胞在失巢培養(yǎng)條件下發(fā)生的凋亡現(xiàn)象；并經(jīng)過懸浮和貼壁培養(yǎng)的多輪循環(huán)，獲得一種具有懸浮適應-可貼壁特性、并且能夠抵御失巢凋亡的HEK293ar亞群，進而通過多種方法對該細胞亞群的失巢凋亡抗性特性進行研究，并研究該亞群是否是通過建立細胞間連接形成細胞團進

2、而賦予細胞失巢凋亡的抗性。其次，基于失巢凋亡抗性亞群具有的失巢凋亡抗性而以細胞團形式生存和可貼壁培養(yǎng)的雙重特點，對其可能在建立新型瞬時轉染系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的可行性和無載體固定化細胞團培養(yǎng)的增殖特性進行研究。再次，以在失巢條件下可形成細胞團而生存的失巢凋亡抗性亞群HEK293ar和失巢敏感的親本細胞HEK293這一對自然細胞模型研究HAb18G/CD147黏附分子在失巢凋亡抗性細胞中的表達差異，并研究其調節(jié)細胞間連接的作用，進而明確HAb18

3、G/CD147調節(jié)的細胞間連接在失巢凋亡抗性調節(jié)中的作用；同時還研究另外一種黏附分子E-cadherin是否也參與細胞失巢凋亡抗性的調節(jié)，并研究這兩個黏附分子在失巢凋亡抗性調節(jié)中的可能相互聯(lián)系，進而研究HAb18G/CD147調節(jié)的細胞連接在抑制失巢凋亡信號調節(jié)通路中的作用和信號調節(jié)網(wǎng)絡。最后，基于失巢條件下，細胞形態(tài)和骨架發(fā)生的顯著變化，研究失巢敏感HEK293細胞和抗性亞群HEK293ar細胞在失巢條件下主要骨架蛋白的重排方式的差異

4、，并研究HAb18G/CD147和骨架蛋白組織分子plectin之間可能的相互作用，進而研究HAb18G/CD147是否通過plectin而調節(jié)骨架重排的可能性。
　　方法：根據(jù)研究目的，實驗內容共分為四個部分，實驗操作方法簡述如下。
　　1哺乳動物工程細胞可貼壁失巢凋亡抗性亞群（HEK293ar）的獲得
　　建立完全失巢培養(yǎng)模型的培養(yǎng)條件，通過電鏡觀察等研究該細胞在失巢條件下由于發(fā)生失巢凋亡而死亡的時間規(guī)律；通過有限

5、稀釋法獲得HEK293的單細胞克隆株，分別研究其在失巢條件下的失巢凋亡敏感情況；研究細胞失巢模型培養(yǎng)和細胞貼壁培養(yǎng)長時間循環(huán)培養(yǎng)對單克隆細胞群失巢凋亡抗性的影響，進而通過細胞失巢培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的多輪循環(huán)以獲得具有失巢凋亡抗性的可貼壁細胞亞群；長時間失巢培養(yǎng)觀察失巢凋亡抗性亞群的細胞形態(tài)變化，以及不同時間取樣檢測其發(fā)生的失巢凋亡，以驗證其具有失巢凋亡抗性的特性是否穩(wěn)定存在；直接將失巢培養(yǎng)的細胞群在貼壁條件下培養(yǎng)，觀察細胞是否還具有重新貼壁

6、培養(yǎng)的特性。最終以獲得一種具有以建立細胞間連接而成團具有失巢凋亡抗性的可貼壁性細胞亞群。
　　2、抗性細胞亞群HEK293ar細胞在瞬時轉染法生產(chǎn)蛋白和無載體固定化方面的應用研究
　　通過Lipofectin2000試劑分別在失巢敏感細胞HEK293和抗性細胞HEK293ar中高效轉染pEGFP/N1，懸浮培養(yǎng)研究其在懸浮培養(yǎng)條件下生產(chǎn)蛋白的差異；通過Lipofectin2000試劑在抗性細胞HEK293ar中轉染pEGFP

7、/N1，連續(xù)懸浮培養(yǎng)并每天取樣研究其在懸浮條件下生產(chǎn)蛋白效率的變化。重要的，通過建立高效聚乙烯亞胺轉（PEI）染技術，建立基于HEK293ar細胞亞群的高效PEI瞬時轉染技術策略。
　　3、HAb18G/CD147黏附分子參與調節(jié)細胞連接和失巢凋亡抗性的研究
　　以獲得的失巢凋亡抗性亞群HEK293ar和親本細胞HEK293這對細胞為模型，通過流式細胞術測定和westernblot等方法研究HAb18G/CD147黏附分子的

8、表達差異，并研究其在懸浮培養(yǎng)抗性細胞時形成的細胞團中的亞細胞定位；通過RNAi技術下調HAb18G/CD147表達研究其對細胞間連接和細胞凋亡抗性的影響；研究參與調節(jié)細胞間連接和凋亡抗性的另外一種黏附分子E-cadherin在這對細胞間的表達差異，并通過RNAi技術研究下調此蛋白表達對細胞間連接和細胞存活的影響；通過westernblot和免疫熒光法研究下調HAb18G/CD147對E-cadherin表達和細胞生存的影響；通過額外添加

9、EDTA和抗-E-cadherin抗體阻斷細胞間連接研究封閉或破壞E-cadherin作用對細胞表達HAb18G/CD147的影響，并通過RNAi技術下調E-cadherin表達研究其對HAb18G/CD147表達的影響。通過研究添加LY294002（PI-3K通路信號競爭性抑制劑）和PD98059（ERK通路抑制劑）等信號通路抑制劑對失巢凋亡抗性亞群細胞增殖和細胞間連接的影響，研究其參與失巢凋亡抗性調節(jié)的細胞主要信號通路。
　　

10、4、失巢凋亡抗性亞群在失巢培養(yǎng)下的細胞骨架特征和黏附分子HAb18G/CD147之間的關系研究
　　通過形態(tài)觀察研究抗性細胞亞群HEK293ar細胞在失巢條件的細胞連接和細胞成團現(xiàn)象；研究抗性細胞在失巢前后的微纖維絲細胞骨架的特征；通過免疫熒光法研究HEK293ar細胞在失巢培養(yǎng)下actin(G-或F-)、α-tubulin和plectin的骨架重排特征以及HAb18G/CD147的亞細胞定位；采用RNAi干涉HAb18G/CD1

11、47表達研究其對F-actin骨架重排的可能影響；通過免疫熒光法研究失巢凋亡時HAb18G/CD147和plectin參與失巢凋亡調節(jié)的現(xiàn)象；通過免疫熒光雙標記法研究HAb18G/CD147和plectin在失巢培養(yǎng)抗性亞群時的相互作用，通過RNAi下調HAb18G/CD147研究其對失巢培養(yǎng)時這兩個分子相互作用的可能影響。
　　結果：
　　1、成功建立了針對失巢培養(yǎng)HEK293細胞的“完全失巢”模型，并成功用于研究工程細胞

12、HEK293在懸浮條件下發(fā)生的失巢凋亡。觀察到HEK293細胞在失巢條件下發(fā)生染色體斷裂、膜發(fā)泡、DNA斷裂、凋亡小體形成和亞二倍體峰等典型的細胞凋亡現(xiàn)象。得到八株HEK293細胞單克隆細胞，研究得知，親本細胞是由一群有不同失巢敏感程度的細胞亞群而組成的。長時間失巢培養(yǎng)有助于提高細胞的抗失巢凋亡能力。通過利用細胞失巢培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)循環(huán)獲得了一種具有失巢凋亡抗性以細胞團方式生長的可貼壁細胞亞群。該亞群具有穩(wěn)定的失巢凋亡抗性和重新貼壁培養(yǎng)的

13、的特性。
　　2、貼壁轉染EGFP基因后，抗性細胞HEK293ar在懸浮條件下培養(yǎng)到第三天時仍然維持著高效生產(chǎn)蛋白的能力，而親本細胞HEK293則由于發(fā)生失巢凋亡蛋白產(chǎn)率和HEK293ar相比有明顯下降。長時間懸浮培養(yǎng)HEK293ar時，可以維持初始時的高效生產(chǎn)蛋白的能力。利用HEK293ar細胞進行無載體固定化培養(yǎng)時，維持細胞活性在80-87％，比生長速率達到0.05-0.06hr-1，此細胞亞群可以用于無載體固定化培養(yǎng)。建立了

14、基于HEK293ar細胞亞群的高效PEI轉染策略，其轉染效率高達65-75％，而且在懸浮狀態(tài)時可以維持高效生產(chǎn)蛋白的能力。
　　3、利用失巢凋亡抗性細胞HEK293ar和HEK293細胞這對自然細胞研究模型，證實黏附分子HAb18G/CD147內源性表達水平的提高是抗性細胞具有失巢凋亡抗性的重要原因。下調HAb18G/CD147可以導致細胞失巢培養(yǎng)條件下細胞間連接斷裂以及細胞發(fā)生失巢凋亡。成功利用此模型研究證實E-cadherin

15、黏附分子也參與了抗性細胞的抗性調節(jié)。下調HAb18G/CD147可以導致E-cadherin在24hr后逐步降解，細胞間連接斷裂。利用EDTA溶液以及抗E-cadherin抗體阻斷細胞間連接對HAb18G/CD147表達沒有顯著影響，干涉E-cadherin也對HAb18G/CD147表達沒有明顯影響。用PI-3K通路信號競爭性抑制劑LY294002處理抗性細胞對抗性細胞的增殖和細胞間連接有影響，而用ERK通路抑制劑PD98059處理卻

16、沒有同樣的效果。
　　4、闡明了HEK293ar在失巢培養(yǎng)條件下細胞間連接加強和微纖維絲骨架重排的現(xiàn)象；抗性細胞亞群HEK293ar骨架重排在失巢條件下和貼壁下相比呈現(xiàn)紊亂的F-actin排布形式(aberrantcytoskeletondistribution）；通過免疫熒光法研究得知，HEK293ar細胞在失巢下細胞骨架蛋白actin、α-tubulin和plectin均呈現(xiàn)紊亂的重排形式，而且和親本細胞相比，其表達均有所上調

17、。下調HAb18G/CD147導致抗性細胞HEK293ar失巢條件下的F-actin發(fā)生重排，表達變弱，呈現(xiàn)典型的細胞發(fā)生凋亡時的骨架重排現(xiàn)象，在細胞邊緣以及表面突起處部分表達變強；發(fā)現(xiàn)抗性細胞亞群在失巢培養(yǎng)時，plectin和HAb18G/CD147的表達存在部分共定位，兩分子在抗性細胞中的表達呈正相關（0

18、p”接近于1；干涉HAb18G/CD147后發(fā)現(xiàn)，兩分子在細胞內的共定位率有明顯減少，“Mander'soverlap”系數(shù)減少，說明其共定位程度減少。Plectin和HAb18G/CD147分子在細胞發(fā)生失巢凋亡時參與了凋亡小體的形成。
　　結論：
　　1、成功獲得具有失巢凋亡抗性的貼壁性HEK293ar細胞亞群，以用做研究細胞間連接和工程細胞團生長時的細胞模型，此細胞亞群的獲得為建立高效便宜的瞬時轉染系統(tǒng)奠定了細胞基礎，

19、也是進行無載體固定化培養(yǎng)的適宜細胞亞群。
　　2、成功建立了基于抗性細胞亞群HEK293ar的雙階段瞬時高效轉染生產(chǎn)藥物蛋白策略，證明了此細胞亞群適宜于用于建立高效轉染細胞生產(chǎn)蛋白平臺，并且也適宜作為一種重要的無載體固定化培養(yǎng)的細胞亞群。
　　3、利用此模型細胞研究了HAb18G/CD147黏附分子調節(jié)的細胞間連接抑制失巢凋亡抗性的信號通路，得出結論為：HAb18G/CD147調節(jié)的細胞連接是以E-cadherin-PI-3