雞MHCⅡ類分子基因片段原核表達及其單抗的制備與鑒定.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)是脊椎動物中的一個高度多態(tài)性的基因群，其遺傳變異對多數(shù)物種的抗病性與生存有重要影響。雞MHCⅡ類(B-L)分子基因由非多態(tài)的a鏈基因和高度多態(tài)性的β鏈基因組成。編碼產(chǎn)物提呈加工后的外源性抗原給CD4+T細胞，在細胞介導(dǎo)免疫和體液免疫中起重要作用。為了建立雞MHCⅡ分子的檢測方法，進一步研究其基因的分子結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)功能。本研究進行了雞MHCⅡ分

2、子部分基因的原核表達、單抗制備與鑒定。
　　 首先，通過生物信息學(xué)方法對GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的多個雞不同個體MHCⅡ類a、β鏈基因序列進行比對分析，選取雞MHCⅡ類分子較為保守的兩段序列，分別為a鏈第2～6外顯子和β鏈第3～6外顯子序列，參照GenBank中雞MHCⅡa(登錄號：AY357254)和MHCⅡβ(登錄號：S66480)的mRNA序列以及pET-32a、pGEX-4T-1載體多克隆位點序列，分別設(shè)計兩對引物，以

3、本實驗室克隆的雞MHCⅡa鏈和β鏈基因構(gòu)建的pEGFP-Nl-Ⅱa與pEGFP-N1-IIβ質(zhì)粒為模板，分別構(gòu)建四個表達重組質(zhì)粒pET-32a-Ⅱa、pET-32a-Ⅱβ36、pGEX-4T-1-Ⅱa和pGEX-4T-1-Ⅱβ36。PCR鑒定和序列測定結(jié)果表明，各重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 其次，誘導(dǎo)原核表達四個融合蛋白His-Ⅱa、His-Ⅱβ36、GST-Ⅱa和GST-Ⅱβ36，鑒定融合蛋白His-Ⅱa、His-Ⅱβ36的表達

4、形式，并優(yōu)化其表達條件后進行大量表達。用酶解、反復(fù)凍融和超聲相結(jié)合的方法裂解表達菌，提取融合蛋白，再對其進行純化、透析復(fù)性。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒均在大腸桿菌中得到表達，獲得分子量約為44.0KD、35.8D、50.0KD、41.8KD的融合蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符，重組菌(pET-32a-ⅡⅡa、pET-32a-Ⅱβ36)均在0.2mmol/LIPTG誘導(dǎo)4h下表達效果最好，并獲得了高純度的以包涵體形式表達的融

5、合蛋白His-Ⅱa、His-Ⅱβ36。
　　 最后，分別用純化融合蛋白His-Ⅱa、His-Ⅱβ36免疫Balb/c小鼠，獲得的免疫鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，制備相應(yīng)的單抗，經(jīng)間接ELISA篩選、Western-blot鑒定表明，分別成功制備了一株針對雞MHCⅡa鏈的特異性單抗Ⅱa-4和兩株針對雞MHCⅡβ鏈保守區(qū)的特異性單抗Ⅱβ36-2、Ⅱβ36-31。間接ELISA測定制備的相應(yīng)腹水效價分別為1:2.6×105、1:1.