肝癌相關(guān)抗原GCF2基因同源片段的原核表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建肝癌相關(guān)抗原GCF2基因同源片斷(323-1234bp)原核表達(dá)重組質(zhì)粒，并進(jìn)行原核表達(dá)和鑒定，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)利用互聯(lián)網(wǎng)上蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)軟件對(duì)人GCF2蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析;
　　(2)提取人肝癌組織總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA;根據(jù)GenBank公布的GCF2基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR法擴(kuò)增出人GCF2基因片斷(編號(hào)2-5a)，將此片段連接

2、在克隆載體pGEM-T Easy上進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)酶切、連接將目的片斷重組到原核表達(dá)載體pET-30a上。將重組質(zhì)粒pET-30a/GCF2-5a轉(zhuǎn)化DH5a菌，通過(guò)PCR鑒定篩出正確的重組子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，采用不同的IPTG加入時(shí)機(jī)及加入濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定，以找出最適誘導(dǎo)條件;所得融合蛋白送蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定。
　　結(jié)果:
　　(1)人G

3、CF2蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:GCF2蛋白由752個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量約83kDa，等電點(diǎn)為4.55，無(wú)跨膜螺旋，無(wú)信號(hào)肽;存在較多的T細(xì)胞表位。
　　(2)酶切電泳鑒定結(jié)果顯示GCF2基因同源片段克隆入載體中，測(cè)序結(jié)果證實(shí)克隆的基因序列與GenBank中GCF2基因相應(yīng)序列完全相符;目的基因正確插入表達(dá)載體pET-30a質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，成功誘導(dǎo)表達(dá)出His-GCF2-5a融合蛋白，確定了pET-30a/GCF2-5a體外表

4、達(dá)的優(yōu)化條件:37℃振蕩培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)后，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，繼續(xù)在30℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，可獲得較優(yōu)表達(dá)效果;蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜儀分析所得的肽段與目的蛋白相符。
　　結(jié)論:
　　(1)利用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)了GCF2蛋白的結(jié)構(gòu)域及抗原性，顯示GCF2具有較強(qiáng)的免疫原性和較多的T表位;
　　(2)獲得了含人GCF2基因同源片段重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a/GCF2-5a，并成功表達(dá)出His-GCF2-5