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文檔簡介
1、脫水素最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代,它是植物中的一類胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA蛋白),屬于LEAD-Ⅱ家族,分子量從9到200 KD不等。近年來關(guān)于脫水素的研究發(fā)展很快,特別是逆境下脫水素對植物的保護(hù)作用引起了人們廣泛的關(guān)注。脫水素富含甘氨酸和賴氨酸,具有很高的親水性,能與膜脂結(jié)合阻止水分過多流失,以保護(hù)細(xì)胞免受干旱損傷。另外,脫水素還具有蛋白保護(hù)能力,其K片段的
2、雙親水a(chǎn)-螺旋結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),起到了類似于分子伴侶的作用。
茶樹(Camellia sinensis)是一種多年生亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物,易遭受凍害。所以茶樹抗寒性機(jī)制和抗性育種一直受到較多的關(guān)注。我們在開展茶樹抗寒分子機(jī)理研究中,成功構(gòu)建了低溫誘導(dǎo)下茶樹的SSH文庫,篩選獲得一條脫水素基因片段,用RACE試劑盒擴(kuò)增出基因全長,確認(rèn)為Sk2型茶樹脫水素基因(GenBank登錄號(hào)GQ228834.1),并命名為dhn2。
3、r> 為了解茶樹脫水素基因dhn2的表達(dá)特性與功能,本文以國家品種舒茶早(C.sinensis cv.Shuchazao)為材料,分別進(jìn)行低溫、脫水處理和ABA誘導(dǎo),用Realtime-PCR技術(shù)研究了脫水素基因dhn2在非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄變化。同時(shí),對茶樹脫水素基因dhn2進(jìn)行原核表達(dá)與鑒定,對融合蛋白進(jìn)行親和純化,鑒定其抗脫水性和抗凍性。這些將為深入研究茶樹脫水素的抗逆作用機(jī)理提供參考。
研究取得以下結(jié)果:
4、> (1)通過熒光定量PCR技術(shù)檢測茶樹脫水素基因dhn2在不同脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄方式,發(fā)現(xiàn)dhn2基因能被低溫,脫水和ABA等非生物脅迫所誘導(dǎo)。其中,低溫和干旱脅迫對該基因的誘導(dǎo)作用都較為明顯。推測該基因在茶樹抗寒和抗旱過程中有著重要的作用。
(2)成功構(gòu)建了茶樹脫水素dhn2的原核表達(dá)載體,30℃下0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h,脫水素融合蛋白可獲得最佳表達(dá);經(jīng)SDS-PAGE檢測,分子量為53 KD左右,與
5、預(yù)測的基本一致。用Ni2+-NTA親和層析柱純化,純度可達(dá)90%。采用Anti-Dehydrin多克隆抗體,融合蛋白經(jīng)Western blotting檢測確定為脫水素。
(3)脫水素蛋白體外功能研究表明:脫水處理導(dǎo)致蘋果酸脫氫酶喪失了67%的酶活,乳酸脫氫酶經(jīng)反復(fù)凍融后,酶活力損失達(dá)到80%。在脫水與凍融處理中脫水素蛋白dhn2對MDH和LDH具有明顯的保護(hù)作用。當(dāng)脫水素蛋白與酶蛋比為4時(shí),MDH酶活可保留86%,LDH酶
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