茶樹脫水素基因dhn2的原核表達(dá)和體外功能鑒定.pdf

1、脫水素最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，它是植物中的一類胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白)，屬于LEAD-Ⅱ家族，分子量從9到200 KD不等。近年來(lái)關(guān)于脫水素的研究發(fā)展很快，特別是逆境下脫水素對(duì)植物的保護(hù)作用引起了人們廣泛的關(guān)注。脫水素富含甘氨酸和賴氨酸，具有很高的親水性，能與膜脂結(jié)合阻止水分過(guò)多流失，以保護(hù)細(xì)胞免受干旱損傷。另外，脫水素還具有蛋白保護(hù)能力，其K片段的

2、雙親水a(chǎn)-螺旋結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，起到了類似于分子伴侶的作用。
　　 茶樹(Camellia sinensis)是一種多年生亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物，易遭受凍害。所以茶樹抗寒性機(jī)制和抗性育種一直受到較多的關(guān)注。我們?cè)陂_展茶樹抗寒分子機(jī)理研究中，成功構(gòu)建了低溫誘導(dǎo)下茶樹的SSH文庫(kù)，篩選獲得一條脫水素基因片段，用RACE試劑盒擴(kuò)增出基因全長(zhǎng)，確認(rèn)為Sk2型茶樹脫水素基因(GenBank登錄號(hào)GQ228834.1)，并命名為dhn2。

3、r>　　 為了解茶樹脫水素基因dhn2的表達(dá)特性與功能，本文以國(guó)家品種舒茶早(C.sinensis cv.Shuchazao)為材料，分別進(jìn)行低溫、脫水處理和ABA誘導(dǎo)，用Realtime-PCR技術(shù)研究了脫水素基因dhn2在非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄變化。同時(shí)，對(duì)茶樹脫水素基因dhn2進(jìn)行原核表達(dá)與鑒定，對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和純化，鑒定其抗脫水性和抗凍性。這些將為深入研究茶樹脫水素的抗逆作用機(jī)理提供參考。
　　 研究取得以下結(jié)果：

4、>　　 (1)通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)茶樹脫水素基因dhn2在不同脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄方式，發(fā)現(xiàn)dhn2基因能被低溫，脫水和ABA等非生物脅迫所誘導(dǎo)。其中，低溫和干旱脅迫對(duì)該基因的誘導(dǎo)作用都較為明顯。推測(cè)該基因在茶樹抗寒和抗旱過(guò)程中有著重要的作用。
　　 (2)成功構(gòu)建了茶樹脫水素dhn2的原核表達(dá)載體，30℃下0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h，脫水素融合蛋白可獲得最佳表達(dá)；經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，分子量為53 KD左右，與

5、預(yù)測(cè)的基本一致。用Ni2+-NTA親和層析柱純化，純度可達(dá)90％。采用Anti-Dehydrin多克隆抗體，融合蛋白經(jīng)Western blotting檢測(cè)確定為脫水素。
　　 (3)脫水素蛋白體外功能研究表明：脫水處理導(dǎo)致蘋果酸脫氫酶喪失了67%的酶活，乳酸脫氫酶經(jīng)反復(fù)凍融后，酶活力損失達(dá)到80%。在脫水與凍融處理中脫水素蛋白dhn2對(duì)MDH和LDH具有明顯的保護(hù)作用。當(dāng)脫水素蛋白與酶蛋比為4時(shí)，MDH酶活可保留86%，LDH酶