雞白介素6的原核表達(dá)及單抗的研制.pdf

1、雞白介素6(ChIL-6)既參與疾病發(fā)生過程，又可作為免疫佐劑在免疫治療方面起重要作用，是一種多功能的細(xì)胞因子，是當(dāng)前免疫學(xué)研究的熱點。ChIL-6的檢測通常使用免疫學(xué)、生物學(xué)活性測定和分子生物學(xué)等方法。生物學(xué)檢測法較敏感，可以直接測定ChIL-6的生物學(xué)功能，但是該方法需要培養(yǎng)依賴ChIL-6生長的細(xì)胞株，檢測耗時長、步驟復(fù)雜。ELISA方法可用于檢測ChIL-6，但是需要有針對ChIL-6不同抗原表位的抗體。因此，建立一種具有自主產(chǎn)

2、權(quán)的方便、快速、實用的檢測ChIL-6的方法是目前我們急需解決的問題之一。本研究利用原核表達(dá)ChIL-6，獲得了可溶性的ChIL-6，研制并獲得了針對ChIL-6的單克隆抗體，為建立ChIL-6的快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。
　　 通過PCR擴(kuò)增570bp雞IL-6成熟肽基因，克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建pET-ChIL-6重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組雞白細(xì)胞介素-

3、6(rChIL-6)蛋白大小為40kDa左右;可溶性分析表明，rChIL-6蛋白大部分存在于裂解液上清中;生物學(xué)活性測定顯示，10ng/mLrChIL-6即能有效地促進(jìn)IL-6依賴性細(xì)胞系7TD1細(xì)胞的增殖能力;用pcDNA-IL-6質(zhì)粒免疫小鼠所得的血清為一抗進(jìn)行Westernblot，結(jié)果證明rChIL-6具有良好的抗原特異性。
　　 先以pcDNA-IL-6重組質(zhì)粒為免疫原肌肉注射免疫8周齡的Balb/c雌鼠，100μg/

4、只，每2周免疫1次，4免后用rChIL-6蛋白加強免疫一次，取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。以rChIL-6純化蛋白作為篩選的抗原，HIS蛋白為陰性對照，用ELISA方法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，選擇ChIL-6反應(yīng)呈陽性、HIS蛋白反應(yīng)呈陰性的孔進(jìn)行亞克隆，共獲得3株針對雞IL-6的特異性單克隆抗體，分別為1B8、4G8和6C12，腹水的間接ELISA效價分別為:1:64000、1:256000和1:256000;亞類鑒定結(jié)果顯示，4

5、G8為lgG亞類，1B8和6C12單抗均為IgM亞類;3株單克隆抗體均能與pcDNA-IL-6轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生特異性綠色熒光。Westernblot結(jié)果顯示3株單克隆抗體均與rChIL-6和rChIL6-1蛋白反應(yīng)，不與rChIL6-2和HIS蛋白反應(yīng)。6C12單克隆抗體具有中和rChIL-6的促進(jìn)7TD1細(xì)胞增殖的能力。
　　 本研究成功構(gòu)建了ChIL-6成熟肽基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，并且獲得了具有活性的rChIL-6