雞空腸彎曲桿菌CadF蛋白的原核表達及間接ELISA方法的建立.pdf

1、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni），是一種食源性致病菌，近年來，由其引發(fā)的食品安全問題日益突出。全世界每年有大約4-5億人感染該菌，主要臨床表現(xiàn)是以嘔吐、腹瀉癥狀的空腸彎曲桿菌腸炎，甚至繼發(fā)格林-巴利綜合征(Guillain-Barri syndrome，GBS)。開展流行病學調查并對該病進行實時監(jiān)測是有效控制該菌感染的根本途徑，一種快速、準確、敏感性強、適應性強的檢測方法亟需建立。
　　本

2、研究以C.jejuni Q11株為研究對象，DNAStar軟件進行序列分析并設計引物，PCR方法擴增目的基因cadF，然后利用pET32a對cadF基因進行原核表達，構建重組質粒pET32a-CadF，并將重組質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在37℃條件下，以1mmol/L IPTG對重組蛋白進行誘導表達。誘導表達后的重組蛋白通過SDS-PAGE及Westernblot進行驗證。SDS-PAGE分析表明，重組蛋白pET32

3、a-CadF分子量大小為53ku，以包涵體形式存在于沉淀中;Western blot分析表明，該蛋白可與空腸彎曲桿菌全菌陽性血清產生特異性反應，具有良好的反應原性。
　　采用親和層析的方法對帶有His-Tag標簽的蛋白進行純化，以復性的蛋白作為抗原建立了檢測空腸彎曲桿菌血清的間接ELISA方法。對間接ELISA方法的條件進行優(yōu)化，采用Cut-Off值法確定間接ELISA的陰陽臨界值。最終確定所建立方法的最佳條件是:在37℃條件下，

4、抗原包被濃度為1.05μg/mL;包被時間為2h;封閉條件為5％脫脂乳封閉1h;陽性血清稀釋倍數(shù)為1∶100，作用時間為45min;二抗作用濃度和時間分別為1∶5000、45min，顯色時間為10min，臨界值為0.339。利用大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌等常見雞病的陽性血清驗證所建立檢測方法的敏感性、批內重復性及批間重復性驗證對該方法的可重復性進行了解，結果表明此方法具有良好敏感性、重復性及特異性;對血清樣品檢測表明:該方法可應