弓形蟲(chóng)MAG1蛋白的原核表達(dá)及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)呈全球性分布，專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生，能導(dǎo)致人獸共患的弓形蟲(chóng)病。弓形蟲(chóng)感染可引發(fā)很多頑癥如腦病和眼病等，引起母畜流產(chǎn)、死胎，并可對(duì)免疫缺陷動(dòng)物產(chǎn)生致死效果，對(duì)畜牧業(yè)危害比較嚴(yán)重。
　　 MAG1是一種位于組織包囊基質(zhì)部位的蛋白，由于只能在緩殖子階段的包囊的提取物中被檢測(cè)到，而不能通過(guò)免疫印跡在速殖子內(nèi)檢測(cè)到，曾一度被認(rèn)定為是緩殖子階段特異表達(dá)的蛋白。后來(lái)一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)MAG1也能在包裹速殖子

2、的納蟲(chóng)泡內(nèi)被檢測(cè)到，RT-PCR方法和微陣列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也支持了這種觀點(diǎn)。很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MAG1具有優(yōu)良的免疫原性，可刺激宿主產(chǎn)生高滴度的抗體，不僅能為宿主提供免疫性保護(hù)，還可為弓形蟲(chóng)的免疫學(xué)檢測(cè)提供候選蛋白。
　　 本研究旨在建立弓形蟲(chóng)重組MAG1蛋白間接ELISA檢測(cè)體系，首先對(duì)編碼弓形蟲(chóng)基質(zhì)抗原MAG1基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增并原核表達(dá)，然后純化MAG1重組蛋白免疫大白兔，制備抗血清，再用重組MAG1蛋白包被96孔酶免疫反應(yīng)

3、板，采用重組MAG1蛋白免疫大白兔獲得的抗血清作為第一抗體，HRP酶標(biāo)SPA作為第二抗體，OPD作為酶反應(yīng)底物，建立基于MAG1蛋白的間接ELISA方法。
　　 測(cè)序結(jié)果表明，克隆所得的基因片段為目的基因片段。SDS-PAGE和western-blot結(jié)果表明，表達(dá)的重組蛋白為重組MAG1蛋白。該重組蛋白在用Ni2+NTA親和層析法進(jìn)行純化時(shí)，最佳洗脫液液為含8M尿素和100mM咪唑的pH為7.4的PBS溶液。最終建立的間接EL