豬TTV20RF1基因的原核表達以及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬TTV(Torque teno virus)又名豬輸血傳播病毒（transfusion transmitted virus）。屬于細環(huán)病毒科(Anelloviridae)，壬型細環(huán)病毒屬(Iotatorquevirus)。從1999年首次證實TTV存在于豬群中，許多學(xué)者對豬TTV進行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)豬TTV早在1985年就存在于西班牙豬場中，并且已在世界范圍內(nèi)流行。雖然尚未有豬TTV直接致病的報道，但其廣泛流行性以及與其他疾病之間

2、的關(guān)系已經(jīng)使之不容忽視。鑒于目前國內(nèi)對豬TTV的檢測方法仍以PCR為主，本實驗針對國內(nèi)流行的TTV2的ORF1的部分基因進行了表達，并以獲得的純化蛋白作為抗原建立了間接ELISA檢測方法，為該病毒提供了血清學(xué)檢測手段，同時為建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測試劑盒以及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　 1豬TTV2 ORF1的部分基因在大腸桿菌BL21中的克隆與表達本研究根據(jù)Genbank中已發(fā)表的豬TTV2的ORF1基因序列設(shè)計了兩對引物。以提取的TT

3、V2DNA為模板，通過PCR的方法分別擴增出1206bp和855bp兩個片段，將這兩個擴增片段分別插入克隆載體pMD18-T，測序驗證正確。然后分別將兩個克隆質(zhì)粒以及表達載體pcold同時用XhoⅠ和HindⅢ進行雙酶切，將酶切后的兩段基因分別與酶切后的表達載體進行連接，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，用IPTG進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot印跡分析，證實兩種蛋白在大腸桿菌中均得到了高效表達，分子量分別約為52

4、KD和39KD。
　　 2重組蛋白的純化以及多克隆抗體的制備表達的兩種蛋白均以包涵體的形式存在，因此在純化過程中需進行超聲破碎，然后用鎳柱進行純化。將純化的兩種蛋白分別免疫新西蘭大白兔。首免時要將抗原與弗氏完全佐劑1∶1混勻，并于首免之前耳緣動脈采血作為陰性對照。之后每隔兩周免疫一次，并將抗原與弗氏不完全佐劑1∶1混勻，共免疫4次。末次免疫7天后對兔進行心臟采血，經(jīng)Western blot檢測在相應(yīng)位置處有清晰的條帶，間接ELI

5、SA檢測多抗效價達1∶12800。
　　 3間接ELISA檢測方法的建立將純化得到的pcold-g1蛋白作為抗原包被ELISA板，建立了豬TTV2的間接ELISA檢測方法，并確定了間接ELISA檢測的最佳條件:抗原最佳包被濃度為1.65μg/ml，血清最佳稀釋度為1∶160，最佳包被液和封閉液分別為碳酸鹽緩沖液和2％脫脂奶粉，最佳包被條件為4℃包被過夜，最佳封閉時間為37℃2h，血清作用時間1h，二抗?jié)舛?∶4000，二抗37℃