弓形蟲表面抗原SAG3基因RNAi以及原核表達(dá)體系的建立.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種呈世界性分布的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可寄生在除紅細(xì)胞外的所有有核細(xì)胞中，引起人獸共患的弓形蟲病。弓形蟲是一種重要的機(jī)會(huì)性致病原蟲，免疫功能受損或缺陷者感染后，如腫瘤病人，AIDS患者等，可引起全身播散性損害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。妊娠期感染弓形蟲可通過胎盤垂直傳播，引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎或嬰兒發(fā)育畸形等。近年來，由于艾滋病的廣泛流行和寵物飼養(yǎng)的逐漸增多，弓形蟲的危害也日益突出，弓形蟲感染成為

2、一個(gè)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，但是至今仍無治療弓形蟲病安全有效的藥物，深入了解其致病機(jī)制對(duì)于弓形蟲病的防治具有重要的意義。 入侵宿主細(xì)胞、逃避宿主免疫防御是弓形蟲致病的首要條件，弓形蟲表膜蛋白中的SRS(SAG1-related sequence)蛋白家族在其中起了重要的作用。已有的研究結(jié)果顯示，SRS蛋白超家族可能為弓形蟲入侵多種受體細(xì)胞提供了豐富的受體表位，介導(dǎo)弓形蟲對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別、粘附和入侵。弓形蟲可能利用SRS表面抗原的

3、差異性表達(dá)來逃避宿主免疫清除，維持持續(xù)感染。有些SRS蛋白家族成員的表達(dá)還可能直接影響弓形蟲的毒力。由于技術(shù)方法的限制，目前研究最多的SRS蛋白家族成員是SAG1,對(duì)其他的SRS蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)和功能研究較少。近年來，RNAi技術(shù)的發(fā)展以及重組蛋白體外表達(dá)技術(shù)的成熟，為深入研究基因的功能提供了切實(shí)可行的方法和手段。 SAG3是SRS蛋白超家族的重要成員之一。其與SAG1具有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)且均可介導(dǎo)弓形蟲與宿主細(xì)胞的粘附。但與S

4、AG1不同的是，其在弓形蟲速殖子與緩殖子期均有表達(dá)，且具有較低的免疫原性。但是SAG3在弓形蟲致病機(jī)制中的地位和作用目前知之甚少，為了深入研究SAG3的功能，本研究建立了弓形蟲SAG3基因RNAi以及原核表達(dá)體系，希望為進(jìn)一步研究基因的功能以及分析功能結(jié)構(gòu)域奠定基礎(chǔ)。 研究目的:建立弓形蟲SAG3基因RNAi以及原核表達(dá)體系，為近一步研究SAG3的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。 研究方法: 1）SAG3 RNAi體系的建立

5、：以弓形蟲SAG3基因3’-UTR區(qū)及CDS區(qū)為靶目標(biāo)體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNAs，通過電轉(zhuǎn)法化將其分別導(dǎo)入弓形蟲速殖子體內(nèi)，用轉(zhuǎn)染后的弓形蟲感染 SMMC7721細(xì)胞，顯微鏡下觀察蟲體形態(tài)學(xué)上的改變并利用半定量RT-PCR對(duì)RNAi效果進(jìn)行分析鑒定。 2）pET30-SAG3原核表達(dá)體系的建立：從弓形蟲RH株基因組DNA中擴(kuò)增出SAG3基因編碼序列，克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+)中，序列測(cè)定正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（D

6、E3）菌株，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)。利用SDS-PAGE和Western Blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 研究結(jié)果 1）建立了通過電轉(zhuǎn)化構(gòu)建轉(zhuǎn)基因弓形蟲的方法，篩選出了可以有效抑制弓形蟲SAG3基因的dsRNA序列，初步確定了弓形蟲中RNAi發(fā)生及持續(xù)時(shí)間：轉(zhuǎn)染12h后，顯微鏡下觀察蟲體形態(tài)學(xué)改變檢測(cè)干擾效果，可見干擾組細(xì)胞外的弓形蟲數(shù)明顯少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。分別于轉(zhuǎn)染12h、24h、48

7、h后，RT-PCR檢測(cè)SAG3基因 mRNA，檢測(cè)干擾效果。結(jié)果顯示dsRNA轉(zhuǎn)染組，SAG3 mRNA水平明顯低于未轉(zhuǎn)染dsRNA的空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。其中以電壓0.4kv，時(shí)間延遲為9ms的3’UTR dsRNA轉(zhuǎn)染組效果最好。轉(zhuǎn)染12h后，即有較明顯的干擾效果。轉(zhuǎn)染24h后，干擾效果最為顯著，轉(zhuǎn)染后48h的干擾效果不如12h和24h好。作為內(nèi)參照的β微管蛋白的mRNA表達(dá)量的改變與其同組目的基因mRNA表達(dá)量變化趨勢(shì)相一致。

8、 2）構(gòu)建了pET30-SAG3原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序證明，其與GenBank中所給出的序列號(hào)為AF340227的基因序列完全吻合，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE凝膠電泳得到一約43kDa的融合蛋白，經(jīng)western blot鑒定其可與6xHis抗體相結(jié)合。 結(jié)論 1）初步建立了有效的SAG3基因表達(dá)干擾體系，為深入研究SAG3基因的功能及開展弓形蟲功能基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 2）成功構(gòu)建了pET30a