弓形蟲表面抗原SAG3基因RNAi以及原核表達體系的建立.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種呈世界性分布的專性細胞內寄生原蟲，可寄生在除紅細胞外的所有有核細胞中，引起人獸共患的弓形蟲病。弓形蟲是一種重要的機會性致病原蟲，免疫功能受損或缺陷者感染后，如腫瘤病人，AIDS患者等，可引起全身播散性損害，嚴重者可導致死亡。妊娠期感染弓形蟲可通過胎盤垂直傳播，引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎或嬰兒發(fā)育畸形等。近年來，由于艾滋病的廣泛流行和寵物飼養(yǎng)的逐漸增多，弓形蟲的危害也日益突出，弓形蟲感染成為

2、一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，但是至今仍無治療弓形蟲病安全有效的藥物，深入了解其致病機制對于弓形蟲病的防治具有重要的意義。 入侵宿主細胞、逃避宿主免疫防御是弓形蟲致病的首要條件，弓形蟲表膜蛋白中的SRS(SAG1-related sequence)蛋白家族在其中起了重要的作用。已有的研究結果顯示，SRS蛋白超家族可能為弓形蟲入侵多種受體細胞提供了豐富的受體表位，介導弓形蟲對宿主細胞的識別、粘附和入侵。弓形蟲可能利用SRS表面抗原的

3、差異性表達來逃避宿主免疫清除，維持持續(xù)感染。有些SRS蛋白家族成員的表達還可能直接影響弓形蟲的毒力。由于技術方法的限制，目前研究最多的SRS蛋白家族成員是SAG1,對其他的SRS蛋白家族成員的結構和功能研究較少。近年來，RNAi技術的發(fā)展以及重組蛋白體外表達技術的成熟，為深入研究基因的功能提供了切實可行的方法和手段。 SAG3是SRS蛋白超家族的重要成員之一。其與SAG1具有相似的三級結構且均可介導弓形蟲與宿主細胞的粘附。但與S

4、AG1不同的是，其在弓形蟲速殖子與緩殖子期均有表達，且具有較低的免疫原性。但是SAG3在弓形蟲致病機制中的地位和作用目前知之甚少，為了深入研究SAG3的功能，本研究建立了弓形蟲SAG3基因RNAi以及原核表達體系，希望為進一步研究基因的功能以及分析功能結構域奠定基礎。 研究目的:建立弓形蟲SAG3基因RNAi以及原核表達體系，為近一步研究SAG3的結構與功能奠定基礎。 研究方法: 1）SAG3 RNAi體系的建立

5、：以弓形蟲SAG3基因3’-UTR區(qū)及CDS區(qū)為靶目標體外轉錄合成dsRNAs，通過電轉法化將其分別導入弓形蟲速殖子體內，用轉染后的弓形蟲感染 SMMC7721細胞，顯微鏡下觀察蟲體形態(tài)學上的改變并利用半定量RT-PCR對RNAi效果進行分析鑒定。 2）pET30-SAG3原核表達體系的建立：從弓形蟲RH株基因組DNA中擴增出SAG3基因編碼序列，克隆入原核表達載體pET-30a(+)中，序列測定正確后，轉化大腸桿菌BL21（D

6、E3）菌株，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導表達。利用SDS-PAGE和Western Blot對表達產(chǎn)物進行鑒定。 研究結果 1）建立了通過電轉化構建轉基因弓形蟲的方法，篩選出了可以有效抑制弓形蟲SAG3基因的dsRNA序列，初步確定了弓形蟲中RNAi發(fā)生及持續(xù)時間：轉染12h后，顯微鏡下觀察蟲體形態(tài)學改變檢測干擾效果，可見干擾組細胞外的弓形蟲數(shù)明顯少于空白對照組和陰性對照組。分別于轉染12h、24h、48

7、h后，RT-PCR檢測SAG3基因 mRNA，檢測干擾效果。結果顯示dsRNA轉染組，SAG3 mRNA水平明顯低于未轉染dsRNA的空白對照組和陰性對照組。其中以電壓0.4kv，時間延遲為9ms的3’UTR dsRNA轉染組效果最好。轉染12h后，即有較明顯的干擾效果。轉染24h后，干擾效果最為顯著，轉染后48h的干擾效果不如12h和24h好。作為內參照的β微管蛋白的mRNA表達量的改變與其同組目的基因mRNA表達量變化趨勢相一致。

8、 2）構建了pET30-SAG3原核表達質粒，經(jīng)測序證明，其與GenBank中所給出的序列號為AF340227的基因序列完全吻合，IPTG誘導表達后，SDS-PAGE凝膠電泳得到一約43kDa的融合蛋白，經(jīng)western blot鑒定其可與6xHis抗體相結合。 結論 1）初步建立了有效的SAG3基因表達干擾體系，為深入研究SAG3基因的功能及開展弓形蟲功能基因組學研究奠定基礎。 2）成功構建了pET30a