犬吉氏巴貝斯蟲重組表達抗原檢測技術(shù)的建立及其在流行病學(xué)調(diào)查上的應(yīng)用.pdf

1、吉氏巴貝斯蟲病是由寄生在犬紅細胞內(nèi)一種蜱傳吉氏巴貝斯蟲原蟲所致，犬表現(xiàn)發(fā)熱、貧血、血紅蛋白尿和消瘦，甚至死亡，是我國最常見的犬梨形蟲病（焦蟲）的病原之一。吉氏巴貝斯蟲病在我國多個省市均有報道，但其系統(tǒng)流行病學(xué)和臨床病理特征缺乏研究;診斷主要依賴于血液涂片鏡檢，但這種方法對于紅細胞染蟲率低的非急性感染診斷困難，也不適合樣本數(shù)量大的流行病學(xué)研究。因此，開發(fā)一種特異性及敏感性較高的血清學(xué)診斷試劑，對巴貝西斯蟲流行病學(xué)調(diào)查及小動物臨床診斷具有重

2、要的意義。本研究建立了基于截短型重組抗原（tBgTRAP）的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測技術(shù)，應(yīng)用該方法對來自南京、上海、無錫、杭州和鄭州等地區(qū)不同犬血樣進行檢測，得出犬吉氏巴貝斯蟲病流行病學(xué)的初步數(shù)據(jù)。此外，通過61例臨床吉氏巴貝斯蟲感染犬血液學(xué)及生化指標的分析，研究其臨床癥狀、診斷及其病理學(xué)特征，為臨床診斷和治療提供支持。
　　1犬吉氏巴貝斯BgTRAP蛋白重組表達及其ELISA診斷應(yīng)用價值
　　吉氏巴貝斯蟲BgT

3、RAP蛋白是一個重要的診斷抗原候選分子。為了基于該抗原建立實用的血清學(xué)診斷方法，選取C-末端跨膜區(qū)前，包含TSP功能區(qū)和抗原區(qū)的氨基酸所編碼基因片段，重組表達了一個可溶性截短型BgTRAP抗原，解決了完整蛋白重組表達純化的困難。免疫熒光試驗表明，截短型抗原具有良好的抗原性。純化的截短型抗原作為酶聯(lián)免疫試驗診斷抗原可清晰地區(qū)分陰性及陽性犬血清，并與其他病原感染無交叉反應(yīng)，顯示其診斷的特異性。犬感染吉氏巴貝斯蟲系列血清檢測表明，該抗原可檢測

4、早期感染(4d)和感染200d以后的樣本，顯示其適合感染早期和慢性持續(xù)感染的診斷。結(jié)果表明:重組BgTRAP截短型抗原可作為一種診斷制劑檢測犬吉氏巴貝斯蟲抗體。
　　2南京、無錫、上海及杭州地區(qū)犬吉氏巴貝斯蟲病血清學(xué)調(diào)查
　　應(yīng)用基于BgTRAP截短型抗原的ELISA方法，對來自南京地區(qū)、無錫地區(qū)、上海地區(qū)及杭州地區(qū)2011～2012年就診犬的總計705份血樣進行犬吉氏巴貝斯蟲病的血清學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示南京地區(qū)、無錫地區(qū)、上海

5、地區(qū)及杭州地區(qū)門診犬吉氏巴貝斯蟲感染的血清學(xué)陽性率為分別為20.09％，3.03％，3.37％和0.00％，說明吉氏巴貝斯蟲感染存在明顯的地區(qū)差異。進一步對南京地區(qū)犬樣本進行詳細分析，我們發(fā)現(xiàn)巴貝西蟲感染的臨床發(fā)病率為僅為8.33％(17/204)，顯示本病存在一定的隱性感染率或漏診率;工作犬的吉氏巴貝斯蟲陽性率達47.05％，明顯高于寵物犬20.09％的陽性率;在年齡上，陽性犬在2～6歲占70.73％，說明犬的活動性與感染有相關(guān)性;感

6、染季節(jié)上，春、夏、秋、冬的陽性率分別為23.07％、16％、34.09％和10.34％，表明春秋二季是主要感染季節(jié)，這點與媒介硬蜱活動規(guī)律一致。使用tBgTRAPELASA檢測表明，南京地區(qū)吉氏巴貝斯蟲陽性率明顯高于上海、無錫地區(qū);杭州地區(qū)未檢測到陽性樣本。南京地區(qū)工作犬吉氏巴貝斯蟲陽性率明顯高于普通犬，說明該寄生蟲對工作犬危害高于普通犬。因此，應(yīng)加強對寵物犬尤其工作犬的蜱蟲預(yù)防和環(huán)境控制，降低巴貝斯蟲對犬的危害，進而控制本病在南京地區(qū)

7、的季節(jié)性流行。
　　3鄭州地區(qū)比特斗犬吉氏已貝斯蟲病的血清學(xué)調(diào)查
　　應(yīng)用基于BgTRAP截短型抗原的ELISA方法，檢測了鄭州地區(qū)三個養(yǎng)殖場共計171只比特犬樣本，總的血清陽性率是38％(65/171)，但陽性犬發(fā)病率僅為24.61％(16/65)，表明與普通犬感染吉氏巴貝西類似，多數(shù)為亞臨床感染。感染后康復(fù)犬復(fù)發(fā)率為43％(7/16)。1歲以下陽性率為4.6％(3/65)，1～5歲比特犬陽性率為92.3％(60/65);

8、5歲以上陽性率為3.10％(2/65)。陽性犬中公犬占76.9％(50/65)，母犬占23.1％(15/65)。A犬場為大型比特犬養(yǎng)殖場，血清陽性率為26.72％(35/131)，陽性犬發(fā)病率為17％(6/35)，復(fù)發(fā)率為33.33％(2/6)。B、C犬場為斗犬愛好者養(yǎng)殖戶，吉氏巴貝斯陽性率分別為85.7％(12/14)和69.2％(18/26)，B、C犬場巴貝斯陽性犬發(fā)病率分別為21.42％(3/14)和22.22％(6/26)，顯示

9、吉氏巴貝斯有較高的隱性感染率;B、C犬場吉氏巴貝斯復(fù)發(fā)率為66.66(2/3)和復(fù)發(fā)率為50％(3/6)，表明部分病例不能根治，治療方法還有待改進。96.9％(63/65)的陽性犬有咬斗史，98％(64/65)陽性犬有被咬傷疤痕，表明其主要傳播途徑為血液傳播。吉氏巴貝斯蟲在比特斗犬品種中廣泛傳播，陽性率、發(fā)病率及復(fù)發(fā)率都很高，說明吉氏巴貝斯蟲在比特犬群中隱性感染或康復(fù)帶蟲率較高。其主要傳播途徑為咬傷后的血液傳播，其他感染途徑可能為經(jīng)胎盤

10、垂直傳播。比特犬作為儲蟲宿主及其種群成為吉氏巴貝斯蟲的儲蟲庫在傳播巴貝斯蟲路徑中扮演重要角色
　　461個吉氏巴貝斯蟲病例的臨床特征、臨床病理學(xué)特征及診斷分析
　　對來自南京市三家動物醫(yī)院的61例確診為吉氏巴貝西斯蟲感染病例的臨床特征及血液學(xué)分析結(jié)果為:體溫分布不一。體溫升高的占48.78％(20/41)，體溫正常或偏低的占51.22％(21/41)。食欲減退的占100％，精神沉郁至嗜睡的占100％，黏膜蒼白的占87.8％(

11、37/41)，重度到重度蒼白的占80.48％(33/41)。黃疸表現(xiàn)為輕度黃疸，比例為39.02％(16/41);脾腫大的95％(39/41)，中度到重度腫大的為75(75％)。貧血的分布為:輕度貧血的(37＜HCT＞25)為9.7％、中度貧血的(25＜HCT＞15)為34％及嚴重貧血的(HCT＜15)分別為9.7％、34％及46％?？偟呢氀壤秊?0.2％(37/41)。MCHC低于正常范圍下限的為73％(30/41)。95％(39/

12、41)的病例血小板數(shù)降低。血小板輕度降低(175＜PLT＞100)、血小板中度降低(100＜PLT＞50)及血小板嚴重降低(PLT＜50)分別為21.95％(9/41),21.95％(9/41)及51.21％(21/41)。
　　對30個吉氏巴貝西斯蟲病血涂片的染蟲率的統(tǒng)計結(jié)果為:染蟲率為0.5％-0.8％的為占23.33％(7/30)，染蟲率1％-5％的占66.66％(20/30)，染蟲率5％-30％為占10％(3/30)。球形

13、紅細胞，多染紅細胞，低染性大紅細胞為血液細胞學(xué)主要特征。
　　對20例確診為吉氏巴貝西斯蟲感染病例生化指標的結(jié)果進分析顯示:65％(13/20)的病例總膽紅素(T-BIL)升高，30％(6/20)的病例總膽紅素超過正常范圍的50％，主要與溶血有關(guān);有45％病犬(9/20)ALT升高，有25％(5/20)ALT/AST/ALP值同時升高，表明1/5病例肝細胞受損;有20％(4/20)CRE，BUN同時高于正常范圍，表明1/4病例出現(xiàn)